Method Development for the Chromatographic Separation of Synthetic Cyclic Peptides and Impurities Utilizing a Systematic Protocol and MaxPeak High Performance Surface Technology

Význam tématu

Popis metod pro chromatografické dělení cyklických peptidů je klíčový pro farmaceutický výzkum i kontrolu kvality. Díky zvýšené stabilitě a specifické aktivitě cyklických peptidů je možné vyvíjet účinnější antibiotika s delší biologickou dostupností. Spolehlivá separace látek a jejich nečistot zajišťuje přesné stanovení koncentrace aktivních složek a sledování potenciálně rezistentních bakteriálních kmenů.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo vytvořit robustní chromatografickou metodu pro pět cyklických antibiotických peptidů (oritavancin, dalbavancin, caspofungin, daptomycin, anidulafungin) a následně vyvinout separaci dalbavancinu od jeho známých nečistot. Využit byl systematický protokol z Waters MaxPeak Premier kit spolu s Arc Premier systémem a sloupci s technologií MaxPeak HPS.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda vychází z principů AQbD se třemi kroky: předběžné znalosti, systematické screenování podmínek a cílená optimalizace. Klíčové body:

• Sample preparation v 100% DMSO (0,1 mg/mL).
• LC systém: Arc Premier QSM-r s detekcí PDA 2998 při 214 nm a QDa Mass Detector.
• Kolona: XSelect Premier Peptide CSH C18 (4,6 × 150 mm, 2,5 µm) s MaxPeak HPS povrchem.
• Mobilní fáze: 0,1 % formiová kyselina ve vodě (A) a 0,1 % formiová kyselina v acetonitrilu (B).
• Původní screening gradient 0,5–55 % B/20 min, optimalizovaný gradient 10–70 % B/20 min.
• Teplota kolony: peptidové panel 60 °C, analýza nečistot dalbavancinu 80 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Systematické screeningové testy ukázaly, že kombinace XSelect HPS kolony a formiových kyselin zajišťuje nejlepší rozlišení. Problémy se srážením a degradací peptidů při nižším obsahu organiky byly vyřešeny použitím 100 % DMSO. Optimalizovaný gradient a zvýšená teplota posunuly všechny piky do hlavního běhu a zlepšily tvar a retenci.
Porovnání povrchu MaxPeak HPS se standardní nerezovou armaturou odhalilo:

• nárůst plochy píků až o 62 %, výšky o 67 %, snížení špičatosti o 35 %,
• redukované adsorpce peptidů na povrchu a zlepšená reprodukovatelnost (RSD plochy až o 9 % nižší).

Pro analýzu nečistot dalbavancinu byla na XSelect kolonu optimalizována teplota i gradient. Metoda umožnila plné rozlišení hlavní látky B0 od všech devíti sledovaných nečistot, včetně A1, s akceptovatelnou USP rezolucí a tvarem píků.

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácení času vývoje metod díky systematickému protokolu.
• Zvýšená robustnost a reprodukovatelnost analýzy.
• Eliminace nutnosti kondicionování nerezových komponent.
• Snadná identifikace píků pomocí QDa detectoru.
• Vhodné pro rutinní kontrolu kvality cyklických peptidů a jejich nečistot.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření systematického vývoje metod na další třídy peptidů a biologických makromolekul. Další integrace hmotnostní detekce a pokročilých povrchových technologií může dále zvýšit citlivost a selektivitu analýz. Automatizace screeningových a optimalizačních kroků povede k rychlejší validaci a zavádění metod v GMP prostředí.

Závěr

Systematický protokol Waters MaxPeak Premier v kombinaci s technologií MaxPeak HPS prokázal významné zlepšení chromatografické separace cyklických peptidů i jejich nečistot. Metody vyvinuté na Arc Premier systému poskytují robustní, rychlé a vysoce reprodukovatelné analýzy s nižším rizikem adsorpce a degradace peptidů.

Reference

1. MaxPeak Premier Peptide Reversed-Phase Columns and Method Screening Kit: Start Up Guide. Waters Corporation, 2023.
2. Van Bambeke F. Lipoglykopeptidová antibakteriální činidla v léčbě infekcí gram-pozitivními bakteriemi. Drugs, 2015;75:2073–2095.
3. Xiao P, Pei D. High-Throughput Synthesis and Screening of Cyclic Peptide Antibiotics. J Med Chem, 2007;50(13):3132–3137.
4. Werth BJ et al. Emergence of Dalbavancin Non-Susceptible VISA after Treatment of MRSA BSI. Clin Microbiol Infect, 2018;24(4):429.
5. World Health Organization. World Health Statistics 2023. WHO, 2023.
6. Scheinfeld N. Dalbavancin: A Review for Dermatologists. Dermatol Online J, 2006;12(4).