EAS: Systematic Protocol Utilizing High Performance Surface Technology for the Improved Separation and Quantification of Synthetic Peptides and Associated Impurities

Význam tématu

Makrocyklické peptidové antibiotika, zahrnující například dalbavancin, představují účinnou odpověď na rezistentní bakteriální kmeny. Rychlý vývoj robustních analytických metod je zásadní pro zkrácení doby vývoje a zajištění reprodukovatelnosti výsledků.

Cíle a přehled studie

Tato studie si kladla za cíl implementovat strukturovaný protokol založený na principech analytické kvality navržené (AQbD) k urychlení vývoje metod pro separaci a kvantifikaci syntetických peptidů a jejich nečistot. Provedeno bylo rizikové hodnocení vysokorizikových proměnných, následovaný experimentálním screeningem gradientu a volbou vhodných kolon.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala kapalinovou chromatografii s detekcí PDA a hmotnostního detektoru QDa. Klíčové parametry:

• Systém: Waters Arc Premier QSM-r
• Kolona: XSelect Premier Peptide BEH C18 (2,5 μm, 4,6×150 mm) při 60 °C
• Mobilní fáze A: voda s 0,1 % kyselinou mravenčí, fáze B: acetonitril s 0,1 % kyselinou mravenčí
• Detekce: PDA 214 nm, ACQUITY QDa Mass Detector
• Objem injekce: 10 μL

Hlavní výsledky a diskuse

1) Příprava vzorku: Peptidy ve 100 % DMSO zajistily stabilitu během analýzy.
2) Výběr gradientu: Původní gradient 5–55 % ACN v 20 min nevyhovoval všem sloučeninám, optimalizovaný gradient 10–70 % ACN v 20 min zlepšil tvar píků, rozlišení a reprodukovatelnost.
3) Porovnání povrchových technologií: Kolony MaxPeak Premier vykázaly nižší RSD výšky a plochy píků oproti nerezovým systémům a zvýšily citlivost měření.

Přínosy a praktické využití metody

• Aplikace rizikového hodnocení zkracuje dobu vývoje metod a minimalizuje nečekané problémy.
• MaxPeak Premier technologie zvyšuje reprodukovatelnost a citlivost chromatografie.
• Protokol lze snadno adaptovat na širší panel makrocyklických peptidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metodiky na analýzu dalších makrocyklických antibiotik a jejich metabolitů.
• Integrace vysokorychlostní hmotnostní spektrometrie pro detailní strukturní charakterizaci.
• Automatizace AQbD procesů a využití strojového učení k optimalizaci klíčových parametrů.

Závěr

Strukturovaný protokol založený na principech AQbD a MaxPeak Premier technologii umožňuje rychlou, spolehlivou a reprodukovatelnou separaci syntetických peptidů a jejich nečistot. Metoda prokázala lepší výkon oproti tradičním systémům a nabízí univerzální přístup pro průmyslovou i výzkumnou analytiku.

Reference

1. Luther A., Bisang C., Obrecht D. Advances in macrocyclic peptide-based antibiotics. Bioorg. Med. Chem. 2017, doi:10.1016/j.bmc.2017.08.006.
2. Yang H., Koza S., Shiner S. Reversed-Phase Column Performance for Peptide and Peptide Mapping Separations. Waters.com 2023, 720008035.
3. Zhu D., Ping L., Hong Y., Shen J., Weng Q., He Q. Simultaneous Quantification and Pharmacokinetic Study of Five Homologs of Dalbavancin in Rat Plasma Using UHPLC-MS/MS. Molecules 2020, 25(18):4100.