Comprehensive Aggregate Profiling of Liraglutide and Semaglutide Using an Agilent 1290 Infinity II Bio 2D-LC and Agilent InfinityLab LC/MSD XT

Význam tématu

Liraglutid a semaglutid představují významné syntetické peptidové léky používané k léčbě diabetu a obezity.
Agregace těchto peptidů má zásadní dopad na jejich stabilitu, účinnost a bezpečnost.
Regulační agentury (FDA, EMA) vyžadují podrobnou kontrolu agregátů jako klíčový parametr kvality biofarmaceutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie je komplexní profilování agregátů liraglutidu a semaglutidu kombinací SEC a 2D-LC/MS metod.
Autoři demonstrují separaci monomerů a agregátů pomocí Agilent 1290 Infinity II Bio 2D-LC v kombinaci s Agilent InfinityLab LC/MSD XT.
Analýza zahrnuje separaci, stanovení molekulové hmotnosti a identifikaci kovalentních agregátů.

Použitá metodika a instrumentace

1D-SEC podmínky:

• AdvanceBio SEC 130Å a 300Å kolony (7,8×300 mm, 2,7 µm).
• Mobilní fáze: arginin (1 mg/mL)/acetonitril/acetic acid (35:50:15), teplota 40 °C, průtok 0,6 mL/min.
• Detekce UV při 280 nm.

2D-LC/MS podmínky:

• Agilent 1290 Infinity II Bio 2D-LC se srdcovými ventilky a ASM funkcí.
• Agilent InfinityLab Poroshell CS-C18 100Å (2,1×100 mm, 2,7 µm) pro reverzní fázi.
• Agilent InfinityLab LC/MSD XT s ESI (+), dekonvoluce spekter v OpenLab CDS 2.8.
• Multi-inject pro zvýšení objemu frakcí (4×3,2 s výřezy, 40 µL loop).

Hlavní výsledky a diskuse

Počáteční SEC v fosfátovém pufru vykazovala výrazné tzv. tailing špiček liraglutidu kvůli hydrofobním interakcím.
Optimalizace mobilní fáze přidáním argininu a 50 % acetonitrilu vedla k lepšímu rozlišení a snížení tailingu.
AdvanceBio SEC 300Å sloupec poskytl vyšší rozlišení agregátů nad 120 kDa.
Termální stres (80 °C) vyvolal tvorbu vícero agregátů detekovaných při odlišných retenčních časech.
2D-LC/MS analýza umožnila stanovení přesné molekulové hmotnosti a odlišení reverzibilních a kovalentních agregátů.
Deconvoluce spekter odhalila kovalentní dimerní a oligomerní formy semaglutidu (~2× MW monomeru).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda kombinuje vysoké rozlišení SEC s 2D-LC/MS pro komplexní charakterizaci peptidových agregátů.
Umožňuje QC farmaceutických přípravků, porovnání generických a referenčních formulací a optimalizaci stabilizačních podmínek.
Rychlá identifikace kovalentních nečistot pomáhá při vývoji a validaci výrobních procesů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace mikrofluidních 2D-LC systémů a vysoce rozlišených hmotnostních analyzátorů (Orbitrap, TOF).
Automatizace a softwarová řešení pro pokročilou deconvoluci a chemometrickou analýzu.
Rozšíření metodiky na další peptidové a proteinové terapie, screening stabilizačních aditiv.
Využití umělé inteligence pro predikci a interpretaci agregačních mechanismů.

Závěr

Kombinace Agilent 1290 Infinity II Bio 2D-LC a LC/MSD XT poskytuje robustní platformu pro detailní analýzu peptidových agregátů.
Metoda umožňuje detekci, separaci, stanovení molekulové hmotnosti a klasifikaci agregátů dle jejich povahy.
Tento přístup významně zvyšuje kvalitu a spolehlivost analýzy biofarmaceutik.

Reference

• U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products, Guidance for Industry, 2014.
• U.S. Department of Health and Human Services, FDA, CDER. ANDAs for Certain Highly Purified Synthetic Peptide Drug Products That Refer to Listed Drugs for rDNA Origin, Guidance for Industry, 2021.
• European Medicines Agency. Guideline on the Development and Manufacture of Synthetic Peptides, 2023.
• Zapadka K. L., Becher F. J., Gomes dos Santos A. L., Jackson S. E. Factors Affecting the Physical Stability (Aggregation) of Peptide Therapeutics. Interface Focus 2017, 7(6), 20170030.
• Zapadka K. L. et al. A pH-Induced Switch in Human Glucagon-Like Peptide-1 Aggregation Kinetics. J. Am. Chem. Soc. 2016, 138(50), 16259–16265.
• Powell T., Knight M. J., Wood A., O'Hara J., Burkitt W. Detection of Isopeptide Bonds in Monoclonal Antibody Aggregates. Pharm. Res. 2021, 38(9), 1519–1530.