ADLM: QUANTIFICATION OF THYROGLOBULIN IN SERUM FOR CLINICAL RESEARCH USING SISCAPA WORKFLOW COMBINED WITH LC-MS/MS

Význam tématu

Thyroglobulin je klíčový homodimerní protein syntetizovaný folikulárními buňkami štítné žlázy a slouží jako prekurzor hormonů T3 a T4. Přesná kvantifikace Tg v séru je nezbytná pro monitorování pacientů s poruchami štítné žlázy a odhalení recidiv onemocnění. Konvenční imunotesty mohou být ovlivněny protilátkami anti-Tg, což snižuje spolehlivost výsledků.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na vývoj a validaci LC-MS/MS metody kombinované se SISCAPA workflow pro kvantitativní stanovení Tg v lidském séru. Hlavním cílem bylo vytvořit vysoce citlivý, reprodukovatelný a částečně automatizovaný postup pro klinický výzkum.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow začíná enzymatickou digescí 250 µL séra trypsinem, následným obohacením charakteristického peptidu pomocí protilátek (SISCAPA), elucí a analýzou na LC-MS/MS. Automatizace probíhá na Andrew+ Pipetting Robot s OneLab Software. Klíčová instrumentace:

• Andrew+ Pipetting Robot (Waters) s OneLab Software
• XSelect Premier HSS T3 kolona (2,1×50 mm, 2,5 µm)
• ACQUITY UPLC I-Class FL System
• Xevo TQ Absolute Mass Spectrometer

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje funkční citlivosti 0,1 ng/mL při objemu 250 µL séra a S/N >10:1. Reprodukovatelnost a opakovatelnost jsou ≤9,5 % CV pro QC na úrovních 0,3; 3; 35 ng/mL. Matricové efekty se pohybovaly mezi 79 a 104 % (RSD <9 %) pro plošné odpovědi a 96–105 % (RSD <4 %) pro poměr analyzát/internal standard. V porovnání s UK NEQAS EQA ukázala metoda původní bias –40,1 %, který se po přenastavení kalibrátorů snížil na –5,5 %, s regresí y=–0,261+0,9384x.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá metoda nabízí:

• Vysokou citlivost pro detekci nízkých hladin Tg i při interferujících anti-Tg protilátkách
• Vysokou precision díky interním standardům SISCAPA
• Částečnou automatizaci snižující laboratorní variabilitu
• Možnost opakovaných analýz ze zbytkového objemu

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat multiplexní stanovování více proteinů v jednom běhu, zlepšenou metrologickou stopu kalibrace, miniaturizaci procesu nebo přímou integraci do diagnostických laboratoří. Využití isotopově značených standardů a pokročilá automatizace nabídnou vyšší throughput a standardizaci výsledků.

Závěr

Předložená SISCAPA-LC-MS/MS metoda na platformě Andrew+ poskytuje spolehlivé a citlivé stanovení thyroglobulinu v séru s nízkou mírou interferencí. Metoda je vhodná pro klinický výzkum a má potenciál k rozšíření do rutinního analytického provozu.

Reference

Foley D., Razavi M., Wardle R., Trudeau M., Mira N., Calton L. J. Quantification of Thyroglobulin in Serum for Clinical Research Using SISCAPA Workflow Combined with LC-MS/MS. Waters Corporation 2024.