QUANTIFICATION OF THYROGLOBULIN IN SERUM FOR CLINICAL RESEARCH USING SISCAPA WORKFLOW COMBINED WITH LC-MS/MS

Význam tématu

Thyroglobulin je hlavní prekurzor hormonů štítné žlázy a klíčový marker sledovaný v klinickém výzkumu a monitorování recidivy karcinomu štítné žlázy. Standardní imunotesty však mohou být ovlivněny přítomností protilátek proti thyroglobulinu, které snižují spolehlivost měření. Workflow SISCAPA spojené s LC-MS/MS přináší řešení umožňující přesné stanovení Tg i v náročných matricích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a automatizovat metodu pro kvantifikaci thyroglobulinu ze séra pomocí SISCAPA workflow na robotu Andrew+ a následné analýzy pomocí ACQUITY UPLC I-Class PLUS FL a hmotnostního spektrometru Xevo TQ Absolute. Studie hodnotila funkční a analytickou citlivost, vliv matricových interferencí, reprodukovatelnost a porovnání s externími EQA hodnotami.

Použitá metodika

Laboratorní práce zahrnovala rozpuštění a redukci proteinu, tryptickou digesci, přidání stabilně značeného interního standardu (FSP-SIL), imunoselektivní obohacení pomocí SISCAPA kulí, vyprání a eluční krok. Následovala chromatografická separace na XSelect Premier HSS T3 kolonce (2,1×50 mm, 2,5 µm) pomocí gradientu formiové kyseliny a acetonitrilu v čase 2,6 minuty a detekce MRM přechody FSP peptidu (704.0>586.9, 704.0>687.4) a FSP-SIL (709.0>591.9). Kalibrace probíhala v rozsahu 0,1–50 ng/mL ve slepé matrici kuřecího séra, kontrolní vzorky v lidském séru pak na hodnotách 0,3, 3 a 35 ng/mL.

Použitá instrumentace

• Robot Andrew+ s ovládacím softwarem OneLab
• Autosampler magnetická vložka pro 96-well destičky
• ACQUITY UPLC I-Class FL System
• XSelect Premier HSS T3 kolonka (2,1×50 mm, 2,5 µm, 100 Å)
• Xevo TQ Absolute Mass Spectrometer

Hlavní výsledky a diskuse

Funkční citlivost dosahovala 0,1 ng/mL s poměrem signál/šum >10:1 a přesností <20 % RSD. Celková reprodukovatelnost a opakovatelnost metodiky byla ≤9,5 % CV pro QC vzorky ve třech koncentracích. Matricové efekty v šesti lidských sérech se pohybovaly mezi 79 % až 104 % (plošný signál) a 96 % až 105 % (poměr analyzát/interní standard) s RSD <9 % a <4 %. Porovnání s 38 EQA vzorky UK NEQAS ukázalo původní bias -40,1 % oproti ALTM, který po přeassignaci kalibrátorů k EQA ALTM klesl na -5,5 % a regresní parametr Passing-Bablok byl y=-0,261+0,9384x.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí spolehlivé stanovení Tg v přítomnosti anti-Tg protilátek, nízkou spotřebu vzorku (250 µL), vysokou analytickou citlivost a automatizaci kroku přípravy, což zkracuje pracovní čas a minimalizuje variability. Je vhodná pro klinický výzkum, externí kontrolu kvality i metrologicky sledovatelná stanovení.

Budoucí trendy a možnosti využití

Potenciál spočívá v rozšíření SISCAPA-LC-MS/MS na multiplexní analýzy dalších biomarkerů, plné integraci do klinických laboratoří, digitalizaci datových workflow a využití umělé inteligence pro pokročilou interpretaci výsledků. Dalším krokem je standardizace kalibrace napříč laboratořemi a validace metody pro diagnostické použití.

Závěr

Vyvinutá a automatizovaná metoda kombinující SISCAPA a LC-MS/MS poskytuje robustní, citlivé a přesné stanovení thyroglobulinu ze séra. Díky nízkému biasu a vysoké reprodukovatelnosti představuje atraktivní nástroj pro klinický výzkum a kontrolu kvality stanovení Tg.