Determining the Kinetics of Covalent Thrombin-Antithrombin Association

Význam tématu

Inhibice trombinu antitrombinem III je klíčová v regulaci koagulace. Kvantifikace kinetiky vzniku kovalentního komplexu přispívá k pochopení protrombotických i antitrombotických mechanismů. Metoda CG-MALS umožňuje přímé měření rychlosti reakce v roztoku bez potřeby značení.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo stanovit druhý řád konstanty rychlosti asociace trombinu-α s antitrombinem III za fyziologických podmínek. Experiment využívá časově závislé sledování kovalentní vazby 1:1 mezi těmito dvěma proteiny pomocí Composition Gradient Multi-Angle Light Scattering.

Použitá metodika a instrumentace

• Kalypso II pro přípravu gradientu složení
• UV/Vis detektor pro měření koncentrace
• HELEOS MALS detektor pro stanovení rozptylu světla
• Protokol: šest injekcí s konstantní koncentrací antitrombinu (60 µg/ml) a rostoucími koncentracemi trombinu (0–30 µg/ml), každé zastavení toku na 2000 s pro dosažení rovnováhy

Hlavní výsledky a diskuse

Data prokázala pomalý nárůst intenzity rozptylu světla během 10–20 minut odpovídající tvorbě trombin-AT komplexu. Globální fit modelu 1:1 nevratné asociace vedl k hodnotě konstanty rychlosti k = 6,09×10^3 M-1s-1. Frakce kompetentního trombinu byla stanovena na ~77 %, což se shoduje se specifickou aktivitou antitrombinu udávanou výrobcem.

Přínosy a praktické využití metody

• Přímé sledování protein–protein interakcí bez značení
• Současné získání kinetických parametrů a podílu aktivních molekul
• Využití v QA/QC procesů a farmacii pro studium inhibitorů proteáz

Budoucí trendy a možnosti využití

• Studium komplexních biologických systémů včetně vlivu glykosaminoglykanů
• Integrace s dalšími bioanalytickými technikami pro komplexní popis interakcí
• Automatizované vysokopropustné platformy pro screening proteázových inhibitorů

Závěr

CG-MALS umožnila real-time sledování nevratných protein–protein interakcí bez nutnosti modifikace vzorků. Metoda poskytuje přesné kinetické parametry i informaci o frakci aktivních molekul.

Reference

• Some D., Kenrick S. Characterization of Protein-Protein Interactions via Static and Dynamic Light Scattering. In Protein Interactions; InTech, 2012.
• Izaguirre G. et al. J. Biol. Chem. 2007, 282, 33609.
• Rosenberg R.D., Rosenberg J.S. J. Clin. Invest. 1984, 74, 1.
• Bernocco S. et al. Biophys. J. 2000, 79, 561.
• Rocco M. et al. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2001, 936, 167.
• Wei G.J. et al. Biochemistry. 1982, 21, 1949.