Analysis & Purification of Therapeutic Oligonucleotides: Method Development Optimization from the Analytical Scale Through Semi-prep and Preparative Purification

Význam tématu

Oligonukleotidy představují klíčovou skupinu biologicky aktivních molekul schopných cíleně modulovat genovou expresi. Složitost jejich sekvencí a přítomnost blízce příbuzných nečistot vyžaduje robustní analytické a purifikační metody pro vývoj a výrobu terapeutických kandidátů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a optimalizovat iontově párovou reverzní HPLC pro oddělení cílového oligonukleotidu od podobně elujících nečistot na analytické úrovni a zajistit bezproblémový přechod metody na polopreparativní a preparativní stupně při zachování vysokého rozlišení a výtěžnosti.

Použitá metodika

• Iontově párová reverzní fáze (IP RP) s alkylaminy (triethylamin, tripropylamin, hexylamin, dibutylamin) pro zvýšení retence aniontové kostry oligonukleotidů na C18 stacionární fázi.
• Optimalizace pracovních podmínek: teplota kolony (25 °C vs 60 °C) pro eliminaci sekundárních struktur a ostřejší tvary píků.
• Využití snížené viskozity mobilní fáze při vyšších teplotách k dalšímu zlepšení rozlišení a snížení provozního tlaku.

Použitá instrumentace

• Agilent Technologies HPLC systémy s ohřevem kolony.
• Analytické kolony AdvanceBio Oligonucleotide 2,7 µm, 2,1×50 mm a 4,0 µm, 4,6×150 mm.
• Polopreparativní kolony AdvanceBio Oligonucleotide 4,0 µm, 10×150 mm.

Hlavní výsledky a diskuse

• Hydrofobnější iontově párovací činidla výrazně zvyšují retenci a umožňují oddělit cílový produkt od blízce elujících nečistot.
• Zvýšení teploty na 60 °C vedlo k ostřejším píkům a lepšímu rozlišení plné délky oligonukleotidu od nečistot.
• Metoda byla úspěšně škálována z analytické kolony (4,6×150 mm, 0,424 mL/min) na semi-prep rozměr (10×150 mm, 2,0 mL/min) se zachováním selektivity.
• Čtyřnásobná injekce 160 µL (3,2 mg) surového vzorku přinesla frakční čistoty až 99,2 % s výtěžností 33,4 % v hlavní frakci a nad 97 % v několika dalších frakcích.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Rychlou a reprodukovatelnou analýzu kvality surových a polopreparativních vzorků oligonukleotidů.
• Jednoduchý přenos metody mezi různými vnitřními průměry kolon pro výzkum i průmyslovou QA/QC.
• Vysokou čistotu produktu vhodnou pro biologické testy a předklinické aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj nových povrchových chemologií odolných vůči extrémním pH a teplotám.
• Automatizace a integrace softwarových nástrojů pro řízení preparativních HPLC MS procesů.
• Rozšíření aplikace na větší molekuly jako CRISPR guide RNA a modifikované oligonukleotidy.

Závěr

Optimalizovaná IP RP HPLC metoda s iontovým párováním a zvýšenou teplotou poskytuje efektivní cestu k vysoce produktivnímu analytickému a preparativnímu čištění terapeutických oligonukleotidů. Škálující AdvanceBio Oligonucleotide kolony umožňují hladký přechod od analytické fáze k polopreparativní a produkční purifikaci.

Reference

• Superficially Porous Columns for Semi Preparative Purification of Synthetic Oligonucleotides Agilent Technologies aplikační poznámka 5994 7478 EN 2024
• Fast and Selective Purification of Oligonucleotides Using Preparative HPLC MS and Software Support Agilent Technologies aplikační poznámka 5994 4877 EN 2022