LC-MS and GC-MS metabolite data processing using Mass Profiler Professional, a chemometric data analysis and visualization tool to determine metabolomic pathways

Význam tématu

Metabolomika v kombinaci s proteomikou a genomikou poskytuje komplexní pohled na buněčné procesy a pomáhá identifikovat změny ve zdravotním stavu i při podávání léčiv, jako je imunusupresivní rapamycin. Integrovaná analýza omiky umožňuje objevit nové biomarkery a pochopit mechanismy působení léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo zhodnotit vliv rapamycinu na buňky linie HEK 293 pomocí multiplatformního metabolomického přístupu (LC–MS a GC–MS) a integrovat tyto výsledky s paralelními daty genomiky a proteomiky. Studie usiluje o identifikaci klíčových metabolitů ovlivněných léčbou a jejich zařazení do biologických drah.

Použitá metodika a instrumentace

Metabolity byly extrahovány z buněk metanol–voda/chloroformem (2:1:2) a zpracovány následujícím způsobem:

• LC–MS: Agilent 6520 ESI-QTOF spojený s Agilent 1290 LC, kolona SB-Aq 2,1×50 mm (1,8 µm), gradient 2→98 % methanolu s 0,2 % kyseliny octové, průtok 0,6 ml/min, pozitivní i negativní ionizace, interní standard epicatechin.
• GC–MS: Agilent 7890 GC s detektorem 5975C MSD, kolona DB-5MS 30 m×0,25 mm (0,25 µm), dvoustupňová derivatizace (methoxyamin hydrochlorid, MSTFA + 1 % TMCS), interní standard d27-myristová kyselina.

Data byla zpracována v softwaru Mass Profiler Professional (MPP) – filtrování, zarovnání, normalizace a statistická analýza.

Hlavní výsledky a diskuse

Po kvalitativní selekci bylo detekováno přes 700 entit v pozitivním LC–MS a přibližně 200 v GC–MS. PCA analýza prokázala jasné oddělení ošetřených a kontrolních vzorků. Statická analýza (t-test a fold change) identifikovala významné změny, např. zvýšené hladiny oxidovaného glutationu, nicotinamidu, vitaminu B6 a snížení glukózo-6-fosfátu. Kombinovaná datová sada ukázala obohacení drah spojených s ABC transportéry, glykolýzou, metabolismem nukleotidů a aminokyselin.

Přínosy a praktické využití metody

Multiplatformní přístup zvyšuje pokrytí metabolomu a robustnost analýzy. Softwarové prostředí MPP zefektivňuje celý workflow od zpracování dat po identifikaci biologicky významných metabolitů a drah. Integrované omické přístupy napomáhají hloubkovému porozumění systémové odezvě buňky a identifikaci potenciálních biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření integrace omických dat (např. lipidomika, fluxometrie), aplikace strojového učení pro hlubší analýzu komplexních datasetů a adaptace workflow na jednovrstevné buněčné modely. Klíčová bude implementace do klinické diagnostiky a personalizované medicíny.

Závěr

Studie ukázala efektivitu kombinace LC–MS a GC–MS pro netargetované metabolomické analýzy rapamycinu v buňkách HEK 293. MPP umožnil identifikaci statisticky významných metabolitů a ovlivněných biologických drah. Výsledky korespondují s dřívějšími studiemi a potvrzují potenciál systémové omické analýzy.

Reference

• Baumann S., Prest H., Jensen M., Muehlbauer M., Bain J., Non-targeted GC/MS metabolomics using a large-volume inlet, mid-column backflushing, and a retention time locked spectral library, ASMS poster, 2010.
• Sana T.R., Fischer S., Wohlgemuth G., Katrekar A., Jung K., Ronald P.C., Fiehn O., Metabolomic and transcriptomic analysis of the rice response to Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Metabolomics 6:451–465, 2010.
• Boccard J., Veuthey J., Rudaz S., Knowledge discovery in metabolomics: An overview of MS data handling, J. Sep. Sci. 33:290–304, 2010.
• Peng T., Golub T.R., Sabatini D.M., The Immunosuppressant Rapamycin Mimics a Starvation-Like Signal Distinct from Amino Acid and Glucose Deprivation, Mol. Cell. Biol. 22(16):5575–5584, 2002.