Proteomics in Multi-omics Workflows Using Yeast as a Model System

Význam tématu

Integrace proteomických dat se stává klíčovým krokem při porozumění komplexním biologickým systémům. Mapování diferenčních proteinů na biochemické dráhy umožňuje rychlejší identifikaci relevantních cílů a navazujících experimentů. Využití víceroómických přístupů (proteomika, metabolomika, genomika) rozšiřuje možnosti interpretace výsledků a podporuje systematický pohled na buněčné procesy.

Cíle a přehled studie

Toto application note demonstruje dvě hlavní pracovní postupy na modelu kvasinky (Saccharomyces cerevisiae):

• tradiční workflow pro objevné proteomické analýzy a
• cílené workflow řízené výsledky z metabolomiky.

Cílem je ukázat, jak lze výsledky z jednoho experimentu (např. metabolomický) využít jako vodítko pro design dalších cílených měření (MRM) a následně data vizualizovat v rámci kontextu biologických drah.

Použitá metodika

Vzorky představovaly kultury kvasinky ošetřené cyklosporinem A, FK506, kalciovým kontrolním roztokem a kontrolními buňkami (WT). Po ukončení expozice bylo provedené lyofilizace, extrakce proteinů pomocí SDS/DTT a mechanické lýzy s kuličkami. Proteiny byly denaturovány, redukovány a podrobeny tryptickému štěpení pomocí FASP protokolu. Každá sérum byla analyzována čtyřikrát.

Použitá instrumentace

• Agilent 6550 iFunnel Q‐TOF MS s nanoHPLC‐Chip (360 nL úložiště, 150 mm×75 µm analytický sloupec C18)
• Agilent 6490 Triple Quadrupole LC/MS ve dynamickém MRM režimu
• Agilent 1200 Series nano LC systém (termostatovaný sampler, binární pumpa)

Hlavní výsledky a diskuse

Ve workflow pro objevnou proteomiku bylo identifikováno 3 446 proteinů a 13 616 jedinečných peptidů při kontrole falešně pozitivních spekter (FDR 1,2 %). Multidimenzionální analýza (PCA) prokázala jasné oddělení ošetřených a kontrolních vzorků. Mapování na drahů superpathway biosyntézy ergosterolu odhalilo silné potlačení klíčových enzymů po ošetření FK506.
V cíleném workflow na základě metabolomických dat bylo zvoleno 15 proteinů z drah záchranné syntézy purinů a metabolitů adeninu a hypoxanthinu. Pomocí nástrojů Spectrum Mill a Skyline byl vytvořen DMRM metodický protokol s 43 peptidy a 166 přechody. Tento přístup zajistil stoprocentní pokrytí zvolených proteinů, kde v objevné fázi byly identifikovány pouze 3 z 15.
Multi‐omics vizualizace pak propojuje data proteomiky a metabolomiky přímo na stejných biochemických drahách, což významně zlepšuje biologickou interpretaci a přehlednost výsledků.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a cílená detekce klíčových proteinů z pohledu metabolomických změn
• Možnost vývoje vysoce citlivých kvantitativních assay (MRM)
• Integrace více typů ómických dat usnadňuje identifikaci nových biologických mechanismů
• Využití robustních nástrojů pro statistiku a vizualizaci podporuje rozhodování v biomedicínském výzkumu i průmyslové analytice

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj směřuje k hlubší integraci genomických, transkriptomických a lipidomických dat. Automatizované workflow a strojové učení budou hrát klíčovou roli v rychlejší analýze komplexních datových sad. Rozšiřování databází a veřejných repozitářů drah podpoří standardizaci a přenositelnost metod.

Závěr

Práce ukázala, že propojení objevné proteomiky s cílenými postupy řízenými metabolomickými informacemi významně zefektivní detekci a kvantifikaci biologicky relevantních proteinů. Výsledná multi‐omics analýza poskytuje detailní obraz buněčných procesů a otevírá cestu k novým experimentálním návrhům a širšímu využití v biotechnologii a farmaceutickém výzkumu.

Reference

1. Jenkins et al., Mass Profiler Professional and Personal Compound Database and Library software facilitate compound identification for profiling of the yeast metabolome: Agilent Technologies 5990-9858EN, 2013.
2. Krokhin O. V., Sequence-Specific Retention Calculator: Analytical Chemistry, 78, 7785-7795, 2006.
3. MacLean B. et al., Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments: Bioinformatics, 26, 966-968, 2010.
4. Picotti P. et al., A complete mass-spectrometric map of the yeast proteome applied to quantitative trait analysis: Nature, 494, 266-270, 2013.
5. Wisniewski J. R. et al., Universal sample preparation method for proteome analysis: Nat Methods, 6, 359-362, 2009.