Benchmarking A Visual Acuity Ion Classifier for MS/MS Deconvolution and 4 Identification of Native Membrane Proteins In Vitro

Význam tématu

Native a top-down hmotnostní spektrometrie umožňují analýzu komplexních biologických systémů v jejich přirozeném stavu. Dekonvoluce komplikovaných spekter je zásadní pro přesné určení hmotností a identifikaci sekvencí proteinů, zejména membránových proteinů, které jsou klíčové pro pochopení funkce buněčných membrán a vývoj cílených léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo otestovat a porovnat výkon vizuálního klasifikátoru IonScore ve verzi 4.6 ExDViewer pro dekonvoluci MS/MS dat z top-down a native top-down spektrometrie. Studie zahrnovala modelové peptidy, monoklonální protilátku a tři proteolipozomy obsahující membránové proteiny VAMP2, Aquaporin Z a semiSWEET izolované z E. coli.

Použitá metodika

Data byla získána přímou infuzí nebo kapalinovou chromatografií. Rozštěpení molekul poskytlo spektra s vysokou složitostí, jež byla dekonvoluována bezparametrickou metodou v ExDViewer. IonScore od 0 do 15 hodnotí shodu mezi experimentálními a teoretickými izotopickými klustery na základě intenzit, chyby m/z a přenosu vodíku.

Použitá instrumentace

• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s ExD buňkou pro elektronové fragmentace
• Thermo QE UHMR s Legacy ExD upgradem (e-MSion, nyní Agilent)

Hlavní výsledky a diskuse

Pro modelové proteiny a peptidy byla dekonvoluce dříve otestována na více než 10000 fragmentech. S IonScore nad 1,5 bylo zachyceno více než 90 % fragmentů s chybovostí pod 2 %. U membránových proteinů v proteoliposomech dekonvoluce dosáhla sekvenční pokrytí 44 % pro VAMP2, 70 % pro semiSWEET a 30 % pro Aquaporin Z. Metoda prokázala vysokou citlivost při detekci slabě intenzivních iontů a usnadnila ruční ověření bez zahlcení falešnými zápasy.

Přínosy a praktické využití metody

ExDViewer nabízí robustní výsledky bez potřeby ladění parametrů, což usnadňuje práci uživatelům s různou úrovní zkušeností. Pro pokročilé aplikace lze parametry upravit a do editoru lze přidat vlastní aminokyseliny nebo posttranslační modifikace, což rozšiřuje využití pro nestandardní proteiny.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšířené srovnání dekonvolučních nástrojů napříč větším spektrem uživatelů
• Integrace strojového učení pro automatizovanou validaci výsledků
• Podpora dalších typů nestandardních modifikací a nekódujících aminokyselin

Závěr

Bezparametrická dekonvoluce v ExDViewer 4.6 poskytuje citlivou a přesnou identifikaci fragmentů v top-down i native top-down hmotnostní spektrometrii. Metoda kombinuje jednoduché výchozí nastavení pro rychlou analýzu s možností pokročilých úprav pro specialisty. To umožňuje širší využití ve výzkumu, vývoji a kvalitativní kontrole biomolekulárních systémů.

Reference

1. Panda A et al Direct determination of oligomeric organization of integral membrane proteins and lipids from intact customizable bilayer. Nat Methods 2023;20(6):891-897.
2. Guthals A et al Parameter-free Deconvolution and Visualization of Peptide and Protein Fragmentation Mass Spectra. ASMS 2023.
3. ExDViewer software: freeware distribuce Agilent Technologies.