Analysis of mRNA 5’ Cap Structure Using a Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometer

Význam tématu

Analýza struktury 5’ cap u mRNA je klíčová pro ověření kvality a účinnosti mRNA vakcín a dalších terapeutik. Modifikace 5’ cap přispívá k rozpoznání mRNA ribozomy, zvyšuje translaci a stabilitu molekuly v buňce, proto je nezbytné sledovat její přítomnost a čistotu během vývoje a kontroly mRNA produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Tato studie si klade za cíl charakterizovat 5’ cap strukturu modelové mRNA s Cap-1 skupinou (m7GpppRm-) o délce 36 nukleotidů a identifikovat možné neúplně modifikované („uncapped“) molekuly jako impurity. K analýze byla použita kombinace vysokorozlišovacího Q-TOF hmotového spektrometru LCMS-9050 a softwaru LabSolutions Insight Biologics.

Použitá metodika

Vzorek mRNA byl připraven in vitro transkripcí z plasmidové DNA a dále enzymaticky štěpen na kratší fragmenty pro usnadnění LC/MS analýzy. Chromatografická separace probíhala na UHPLC Nexera XS inert koloně Shim-pack Scepter Claris C18 (150×2,1 mm, 1,9 μm) s gradientem HFIP/DIPEA a acetonitrilem. Analýza v režimu Data Dependent Acquisition (DDA) zahrnovala záznam MS v rozsahu m/z 550–2500 a MS/MS fragmentaci m/z 100–2500.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Nexera XS inert, Shim-pack Scepter Claris C18-120 (150×2,1 mm, 1,9 μm)
• Hmotový spektrometr: LCMS-9050 (Q-TOF) s ESI v negativním módu
• Software: LabSolutions Insight Biologics pro konfiguraci sekvencí, definici modifikací a vyhodnocení dat

Hlavní výsledky a diskuse

Komponentní chromatogramy prokázaly jasnou separaci Cap-1 modifikovaných fragmentů a neúplných („uncapped“) molekul. Multivalentní iontová analýza odhalila přítomnost kovových aduktů, ale rovněž krátkých přídavných nukleotidů (N+1 skupiny) v poměru kolem 6–8 %, což naznačuje sekundární reakční produkty během transkripce. Softwarová sekvenční pokrytí ve fragmentačních spektrách umožnila lokalizovat modifikace i impurity a stanovit lineární závislost ploch chromatografických pí­ků impurity na zastoupení neúplně modifikované mRNA (R2 > 0,99).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje spolehlivou a citlivou detekci 5’ cap modifikace i vedlejších produktů mRNA ve formě N+1 řetězců a neúplně modifikovaných molekul. Díky softwaru Insight Biologics lze rychle konfigurovat sekvence a cílené modifikace, což zjednodušuje rutinní QA/QC workflow ve vývoji mRNA vakcín a terapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření využití této kombinace LC/MS a pokročilého softwaru pro analýzu různých RNA modifikací, vysokopropustné screenování impurit a integrace strojového učení pro automatizované vyhodnocování dat. Potenciál je i v aplikacích pro detekci vzácných modifikací či degradativních produktů v biologických matricích.

Závěr

Studie potvrdila, že LCMS-9050 spolu s LabSolutions Insight Biologics poskytuje komplexní a kvantitativní analýzu 5’ cap struktury mRNA a jejích impurit. Metoda nabízí vysokou citlivost, přesnost identifikace i sekvenční pokrytí, čímž podporuje vývoj a kontrolu kvality mRNA léčiv.