Superficially Porous Columns for Semi-Preparative Purification of Synthetic Oligonucleotides

Význam tématu

Syntetické oligonukleotidy jsou klíčové pro terapeutické a výzkumné aplikace. Efektivní purifikace odstraňuje nežádoucí vedlejší produkty reakcí a neúplné sekvence, což zlepšuje analytickou kvalitu i biologickou účinnost.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout iontově-párovou reverzní fazovou HPLC metodu pro analýzu a semi-preparativní purifikaci 22mer RNA s možností přímého přechodu z analytické na polopreparativní dimenzi na jednom LC systému.

Použitá metodika a instrumentace

• Iontově-párová RP-HPLC s pufrem TEAA (triethylamoniacetát) připraveným ze 1 M zásobního roztoku.
• Gradient mobilní fáze od 5 do 35 % acetonitrilu s 0,1 M TEAA za 30 minut.
• Teplota kolony optimalizována na 60 °C pro potlačení sekundárních interakcí a snížení viskozity.
• Stacionární fáze: superficially porous částice AdvanceBio Oligonucleotide 4 µm.
• Rozměry kolon: analytické 4,6×150 mm a semi-preparativní 10×50 mm a 10×150 mm.
• Instrumentace:
  • Agilent 1290 Infinity II high-speed pump G7120A
  • Agilent 1290 Infinity II multisampler s termostatem G7167B
  • Agilent 1290 Infinity II multicolumn thermostat G7116B
  • Agilent 1290 Infinity II diode array detector G7117C
  • Agilent 1260 Infinity bio-inert fraction collector G5664A

Hlavní výsledky a diskuse

• pH mobilní fáze 8,65 poskytlo nejlepší rozlišení impurit.
• Zvýšená teplota na 60 °C přinesla ostřejší chromatografické píky a nižší provozní tlak.
• Přechod z kolony 4,6 mm na 10 mm ID při zachování stejné lineární rychlosti vedl k obdobnému rozlišení bez úprav softwaru či hardwaru LC systému.
• Frakcionace po 0,2 min umožnila cílený sběr hlavní frakce s vysokou čistotou.
• Spojením frakcí 8+9 byla dosažena čistota 99,1 % s výtěžkem 59,4 %, optimální výtěžek 79,6 % při čistotě 98,8 % dosáhnuto spojením frakcí 8+10.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje jednoduchý a rychlý scale-up bez nutnosti další chromatografické platformy.
• Zkracuje dobu vývoje metody díky použití jedné LC sestavy pro analýzu i purifikaci.
• Vhodná pro malé až střední objemy vzorku v biotechnologickém a farmaceutickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace superficially porous částic pro zvýšení kapacity a rozlišení.
• Integrace s automatizovanými high-throughput systémy pro masivní purifikaci oligonukleotidů a siRNA.
• Vývoj ekologičtějších mobilních fází s nižším obsahem organických rozpouštědel.

Závěr

Popsaná metoda předvedla univerzální využití jednoho analytického LC systému pro efektivní analýzu i semi-preparativní purifikaci syntetických oligonukleotidů s vysokou čistotou a výtěžkem.

Reference

• Goyon A.; Fan Y.; Zhang K. Analysis of Oligonucleotides by Liquid Chromatography. In Liquid Chromatography Third Edition, vol. 2; Fanali S. a kol., eds.; 2023; s. 357–380.