PEGS: HIGH THROUGHPUT CYSTEINYLATION SCREENING AT MAB SUBUNIT LEVEL USING LC-MS MONITORING WORKFLOW

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) představují klíčovou třídu biotechnologických léčiv. Neohraněné cysteiny v oblasti Fab mohou podléhat nežádoucím modifikacím (cysteinylace, glutathionylace), což ovlivňuje stabilitu, skládání a biologickou aktivitu produktu. Rychlé a spolehlivé stanovení těchto modifikací je nezbytné pro vývoj originálních i biosimilárních mAb a zajištění konzistentní kvality léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo navrhnout a optimalizovat vysokoprůchodový (high-throughput) LC-MS workflow pro kvantifikaci cysteinylace a glutathionylace neohraněných cysteinů na úrovni subjednotek mAb. Studie porovnala originátorovou referenci s šesti biosimilárními vzorky, které se liší ve výrobním procesu.

Použitá metodika a instrumentace

Subunit digesce:

• FabRICATOR® trávení 5 minut za ne-redukčních podmínek.

LC-MS analýza:

• BioAccord™ LC-MS systém s ACQUITY™ Premier UPLC BEH C4 (2,1×50 mm, 1,7 µm).
• Gradient 20→80 % organické fáze B za 3 minuty, vzorek 250 ng.

Peptidová mapování:

• ACQUITY Premier UPLC CSHTM C18 (2,1×100 mm, 1,7 µm) spojené s Xevo™ G3 MS.
• Ne-redukční příprava: alkylace neohraněných cysteinů IAM, digesce RapiZyme™ Trypsin, cílený DDA scanning, kolizní energie ramp.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza originátorové protilátky ukázala 87,9 % subjednotek bez modifikace, 4,2 % cysteinylace a 0,9 % glutathionylace. U šesti biosimilárních vzorků se rozsah cysteinylace pohyboval od 14,9 % do 60,2 % a glutathionylace od 1,6 % do 6,0 %. Vyšší úroveň modifikací korelovala s odlišnostmi ve výrobních podmínkách. Dekonvoluovaná spektra a fragmentační mapy potvrdily lokalizaci modifikací na neohraněných cysteinových zbytcích.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow nabízí:

• Rychlou pětiminutovou digesci a pětiminutové LC-MS měření.
• Možnost vysokoprůchodového screeningu kvality mAb subjednotek.
• Kompletní automatizaci dekonvoluce a reportingu v aplikaci Intact Mass App.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Automatizované on-line monitorování procesů výroby mAb.
• Rozšíření metody na další typy neohraněných zbytků a posttranslačních modifikací.
• Integrace do procesního vývoje (PAT) a kvalifikačních strategií pro regulaci BIOSIM povolení.

Závěr

Navržený ne-redukční subjednotkový LC-MS přístup kombinuje rychlost, citlivost a automatizaci pro spolehlivou kvantifikaci cysteinylace a glutathionylace mAb. Metoda je vhodná pro srovnávací analýzy originátorových a biosimilárních protilátek a podporuje vývoj i kontrolu kvality biofarmaceutik.

Reference

1. Liu H, May K. Disulfide bond structures of IgG molecules: structural variations, chemical modifications and possible impacts to stability and biological function. mAbs. 2012;4(1):17–23.
2. McSherry T, McSherry J, Ozaeta P, et al. Cysteinylation of a monoclonal antibody leads to its inactivation. mAbs. 2016;8(4):718–725.
3. Banks DD, Gadgil HS, Pipes GD, et al. Removal of Cysteinylation from an Unpaired Sulfhydryl in the Variable Region of a Recombinant Monoclonal IgG1 Antibody Improves Homogeneity, Stability, and Biological Activity. J Pharm Sci. 2008;97(2):775–790.