Efficient Non-Reduced mAb Subunit LC-MS Analysis to Screen for Modifications of Unpaired Cysteines in Innovator and Biosimilars

Význam tématu

Sledování modifikací nepaired cysteinů ve variabilní oblasti monoklonálních protilátek je klíčové pro zachování jejich stabilní třetí struktury, biologické aktivity a zajištění shody biosimilárních přípravků s referenčním innovátorem.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem spolupráce mezi Similis Bio a Waters Corporation bylo vyvinout rychlou a spolehlivou LC-MS metodu k identifikaci a kvantifikaci modifikací nepaired cysteinů v porovnání innovátoru a biosimilantů. Studie ukazuje workflow založené na neredukované subunit digesci enzymem FabRICATOR a následné pětiminutové LC-MS analýze.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky mAb byly zpracovány neredukovanou digescí FabRICATOR (5 min, 37 °C). Subunit analýza proběhla na BioAccord LC-MS systému kombinovaném s ACQUITY Premier UPLC a TOF detektorem. Pro potvrzení polohy modifikace bylo použito ne-redukované peptide mappingové štěpení RapiZyme Trypsinem a Xevo G3 QTof s DDA módem.

Použitá instrumentace

• ACQUITY Premier UPLC System s TUV detektorem
• ACQUITY Premier BEH C4 300 Å kolona (2.1×50 mm, 1.7 µm)
• BioAccord LC-MS System s ACQUITY RDa™ detektorem
• FabRICATOR® (Genovis AB) pro subunit digesci
• Waters_connect Informatics Platform s Intact Mass App
• Xevo G3 QTof pro ne-redukované peptide mappingové analýzy
• RapiZyme™ Trypsin pro přímou tryptickou digesci

Hlavní výsledky a diskuse

Po neredukované FabRICATOR digesci se rozlišily dva hlavní subunity: Fc (~25 kDa) a (Fd′+LC)_2 (~100 kDa). Intact Mass App automaticky dekonvolvoval spektra a přiřazoval modifikace (cysteinylace +119 Da, glutathionylace +305 Da, glykace, oxidace). Innovátor vykazoval ~5 % cysteinylace, biosimilanty v širokém rozmezí 16–63 %. Glykace subunity se pohybovala mezi 2–11 %.
Potvrzení lokalizace modifikace proběhlo ne-redukovanou peptide mapping analýzou; disulfidově vázané peptidy (2:T2–2:T7) neselektivně fragmentovány DDA módem potvrdily přítomnost cysteinylace na předpokládaném cysteinu.

Řízené přínosy a praktické využití metody

• Rychlá pětiminutová subunit digescie bez redukce a pětiminutová LC-MS analýza umožňují vysokou propustnost.
• Automatizace datového workflow (Intact Mass App) poskytuje výsledky v reálném čase s minimální manuální úpravou.
• Metoda je vhodná pro rozsáhlé studie vývoje biosimilárních procesů i pro rutinní kontrolu kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření k detekci dalších vzácných modifikací variabilních oblastí protilátek. Integrovaná datová řešení podpoří nasazení v GMP prostředí v rámci kontinuálního monitorování kritických procesních atributů. Kombinace subunit a peptide mappingu může vést k pokročilým multi-atributním metodám (MAM) pro komplexní charakterizaci mAb.

Závěr

Popsaný neredukovaný subunit LC-MS protokol kombinuje rychlou FabRICATOR digesci a BioAccord analýzu s automatizovanou dekonvolucí a reportováním modifikací nepaired cysteinů. Metoda prokázala schopnost citlivě měřit cysteinylaci a glutathionylaci ve vzorcích innovátoru i biosimilantů a splňuje požadavky jak výzkumu, tak kontroly jakosti.

Reference

• 1. Liu H, May K. Disulfide bond structures of IgG molecules: Structural Variations, Chemical Modifications and Possible Impacts to Stability and Biological Function. mAbs. 2012;4(1):17–23.
• 2. Biosimilar Basics for Patients. FDA website. Accessed 7 Nov 2023.
• 3. Banks DD et al. Removal of Cysteinylation from an Unpaired Sulfhydryl in the Variable Region of a Recombinant Monoclonal IgG1 Antibody Improves Homogeneity, Stability, and Biological Activity. J Pharm Sci. 2008;97(2):775–790.
• 4. Ippoliti S, Yu YQ, Ranbaduge N, Chen W. Establishment of a Robust mAb Subunit Product Quality Attribute Monitoring Method Suitable for Development, Process Monitoring, and QC Release. Waters Application Note 70007129. 2021.
• 5. Sokolowska I et al. Subunit Mass Analysis for Monitoring Antibody Oxidation. mAbs. 2017;9(3):498–505.
• 6. Sokolowska I et al. Implementation of a High-Resolution LC-MS Method in Quality Control Laboratories for Release and Stability Testing of a Commercial Antibody Product. Anal Chem. 2020;92:2369–2373.
• 7. Nägeli A, Ekemohn M, Nyhlén H. Automated Middle-level Analysis of Therapeutic mAbs in Complex Protein Samples. Genovis Application Note AN0056.
• 8. Gadgil HS et al. Identification of Cysteinylation of a free Cysteine in the Fab Region of a Recombinant Monoclonal IgG1 Antibody Using Lys-C Limited Proteolysis Coupled with LC/MS Analysis. Anal Biochem. 2006;355:165–174.
• 9. Ippoliti S et al. Versatile and Rapid Digestion Protocols for Biopharmaceutical Characterization Using RapiZyme Trypsin. Waters Application Note 720007840. 2023.
• 10. DeLaney K et al. Applying Peptide Mapping and Multi-Attribute Method Workflow for Biosimilar mAb Drug Products Comparison on the Xevo G3 QTof Platform. Waters Application Note 720007632. 2022.