Carbohydrate analysis by high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAE-PAD)

Význam tématu

HPAE-PAD (aniontově výměnná chromatografie s pulzní amprometrickou detekcí) je již více než 40 let klíčová technika pro separaci a kvantifikaci sacharidů. Umožňuje přímé stanovení bez derivatizace při nízkých picomolárních koncentracích, čímž zefektivňuje analýzu v potravinářství, farmacii, biopalivech, glykomice a dalších oborech.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem Technical Note 70671 je aktualizovat dřívější Dionex Technical Note 20, představit současný stav HPAE-PAD, vysvětlit separační a detekční principy, popsat aniontově výměnné kolony, optimální postupy, limity techniky, přípravu elučních systémů a ilustrovat hlavní aplikace.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci sacharidů se používají polymerní aniontově výměnné kolony Dionex CarboPac (typy PA1, PA10, PA20, PA100, PA200, PA300, MA1, SA10) odolné vysokému pH. Eluenta tvoří NaOH/NaOAc nebo KOH/KMSA generovaná elektrolyticky (Dual EGC Mode). Pulzní amprometrická detekce probíhá na zlaté pracovní elektrodě s referencí Ag/AgCl nebo PdH a counter elektrodou z těla detektoru. Data se zaznamenávají pomocí Chromeleon CDS. Příprava vzorku zahrnuje filtraci, případné srážení proteinů, kyselé či enzymatické hydrolýzy.

Hlavní výsledky a diskuse

• Vysoká selektivita a citlivost k sacharidům s eliminací interference neutrálních či kationtových látek
• Optimalizace gradientů NaOH/NaOAc i KOH/KMSA pro mono-, oligo- a polysacharidy různé velikosti a náboje
• Popis vedlejších reakcí (epimerizace, deacetylace, peeling) při vysokém pH a návod k minimalizaci těchto reakcí
• Představení praktických aplikací: monosacharidové i sialové analýzy glykokonjugátů, profile oligosacharidů z rostlin i potravin, stanovení biofuel sacharidů, cukrových alkoholů i anhydrosacharidů v ovzduší
• Porovnání výkonu nových kolon CarboPac PA300 a SA10 pro specifická použití

Přínosy a praktické využití metody

• Přímé stanovení nativních sacharidů bez derivatizace
• Nízké detekční limity (picomolární rozsah) a ostré piky díky novým pelikulárním pryskyřicím
• Široká využitelnost v kvalitativní i kvantitativní analýze potravin, farmacie a biopaliv
• Kompatibilita s hmotnostní spektrometrií díky elektrolytické desolaci eluentu

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další vylepšení kolona a parametrů vlnové detekce pro vyšší stabilitu a rychlost
• Integrované hyphenované techniky HPAE-PAD/MS pro detailní strukturální analýzu glykánů
• Vývoj nových eluentních systémů a přípravných modulů pro automatizaci
• On-line vzorkovací a čištění vzorků pro vysoce propustnou analytiku

Závěr

HPAE-PAD zůstává jedna z nejuniverzálnějších a nejcitlivějších technik pro analýzu sacharidů. Aktualizace technických poznámek potvrzuje pokračující rozvoj metodologie, výrobního portfolia kolon a detekčních režimů vhodných pro stále se rozšiřující aplikační obory.

Reference

1. Lee, Y.C. Anal. Biochem. 189 (1990) 151–162.
2. Townsend, R.R.; Hardy, M.R. Glycobiology 1 (1991) 139–147.
3. Lee, Y.C. J. Chromatogr. A 720 (1996) 137–149.
4. Cataldi, R.I. et al. Fresenius J. Anal. Chem. 368 (2000) 739–758.
5. Rohrer, J.S. Anal. Biochem. 283 (2000) 3–9.
6. Rohrer, J.S. ACS Symp. Ser. 849 (2003) 16–31.
7. Hardy, M.R.; Rohrer, J.S. Comprehensive Glycoscience Vol. 2 (2007) 303–327.
8. Behan, J.L.; Smith, K.D. Biomed. Chromatogr. 25 (2011) 39–46.
9. Corradini, C. et al. Int. J. Carbo. Chem. 2012 (2012) 487564.
10. Rohrer, J.S.; Basumallick, L.; Hurum, D. Biochemistry (Moskow) 78 (2013) 697–709.
11. Paskach, T.J. et al. Carbohydr. Res. 215 (1991) 1–14.
12. Rohrer, J.S.; Olechno, J.D. Anal. Chem. 64 (1992) 914–916.
13. Rendleman, J.A. Jr. Advances in Chemistry (1973) 51–69.
14. de Bruyn, C.A.L.; van Ekenstein, W.A. Rec. Trav. Chim. 14 (1895) 195.
15. Anderson, R.; Sorenson, A. J. Chromatogr. A 897 (2000) 195–204.
16. Olechno, J.D. et al. Am. Biotech. Lab. 5 (1987) 38–50.
17. Hotchkiss, A.T.; Hicks, K.B. Anal. Biochem. 184 (1990) 200–206.
18. Rocklin, R.D. et al. Anal. Chem. 70 (1998) 1496–1501.
19. Jensen, M.B.; Johnson, D.C. Anal. Chem. 69 (1997) 1776–1781.
20. Rohrer, J.S. Technical Note 21 (2013).
21. Huang, B.; Rohrer, J.S. Technical Note 186 (2016).
22. Hurum, D. et al. Technical Note 110 (2011).
23. Aggrawal, M.; Rohrer, J. Technical Note 73348 (2020).
24. Thermo Fisher Scientific. Electrochemical Detection Manual.
25. Rohrer, J.S. Technical Note 71 (2017).
26. Chen, Y. et al. Anal. Chem. 90 (2018) 10910–10916.