Overcoming Barriers with UHPLC to Achieve Maximum Performance

Význam tématu

Vysokorychlostní kapalná chromatografie (UHPLC) umožňuje zkrácené analýzy a zvýšenou propustnost laboratoře. Maximální výkon však závisí na minimalizaci objemů mimo kolonu a zpožďovacího objemu, aby se zabránilo disperzi a rozšiřování píků.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo identifikovat hlavní bariéry při práci s UHPLC a ukázat, jak optimalizovat konfiguraci přístrojů (kapiláry, spojky, software) pro dosažení nejvyšší efektivity i u malých objemových kolonek.

Použitá metodika a instrumentace

• Systém: Agilent 1290 Infinity LC
• Kolony: ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 (2.1 × 50 mm, 1.8 µm) a ZORBAX RRHD SB-C18 (2.1 × 100 mm, 1.8 µm)
• Kit: Agilent Ultra Low Dispersion Kit a Max Light Cartridge Flow Cell
• Kapiláry o vnitřním průměru 0.075 mm–0.12 mm pro minimalizaci extra column volume
• Detekce: DAD (254 nm) a LC/MS (Agilent 6410A, ESI+)
• Software: ADVR (automatic delay volume reduction)

Hlavní výsledky a diskuse

• Snížení objemu mimo kolonu z 11 µL na 4 µL zvýšilo účinnost a ostrost píků (např. Rs u alkylfenonů vzrostla z 2.96 na 3.67).
• ADVR zmenšil systémový delay z 127 µL na 49 µL, což přineslo kratší retenční časy a lepší separaci v rychlých gradientních větvích.
• Krátké a úzké kapiláry výrazně omezují disperzi, ale vyžadují pečlivou montáž – špatné osazení ferulí vede k mrtvým objemům a protažení píků.
• Volba rychlosti sběru dat je kompromisem mezi rozlišením píků a šumem; optimální nastavení se liší pro DAD a MS detekci.

Přínosy a praktické využití metody

• Zlepšené rozlišení a ostrost píků zvyšují přesnost kvantifikace a snižují vzájemné rušení analytů.
• Rychlejší cykly analýz zvyšují laboratorní propustnost v QA/QC, farmaceutickém i environmentálním prostředí.
• Standardizované postupy pro minimalizaci objemů mimo kolonu lze snadno implementovat napříč různými typy aplikací.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další miniaturizace kapilár a detekčních buněk směřuje k nanoUHPLC pro ultra nízké odběry vzorku.
• Integrace strojového učení pro adaptivní optimalizaci objemů a gradientních programů v reálném čase.
• Vývoj nových kolonek odolných vůči extrémním tlakům s ještě vyšší účinností.
• Propojení UHPLC s pokročilými MS technikami pro hluboké metabolomické a proteomické analýzy.

Závěr

Pro dosažení maximálního výkonu UHPLC je klíčové komplexní přístrojové nastavení: minimalizovat objemy mimo kolonu, optimalizovat zpožďovací objem, dbát na precizní montáž kapilár a využít specializovaný software. Implementace těchto kroků přináší výrazné zlepšení rychlosti, rozlišení i robustnosti metod.

Reference

1. Mack A. Optimizing Performance of an Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 Column by Enhancing an Agilent 1290 Infinity LC System for Ultra Low Dispersion. Agilent Publication 5990-9502EN, April 2012.
2. Mack A. Improve a Waters Method for Aromatic Acids by Using an Agilent ZORBAX RRHD Column and an Agilent 1290 Infinity LC. Agilent Publication 5991-1681EN, December 2012.
3. Mack A. Fully Using Agilent High Efficiency Columns with LC/MS. Agilent Publication 5990-8623EN, January 2012.
4. Posters: Tips for Optimizing your UHPLC Sensitivity and Throughput. Agilent Publications 5991-1749EN, 5990-7594EN, January 2013.