Characterization of adeno-associated viral proteins proteoforms using a top-down MS approach on a UHPLC-Orbitrap Ascend Tribrid mass spectrometer

Význam tématu

Adeno-asociovaný virus (AAV) představuje klíčový vektor v genové terapii díky své vysoké účinnosti a příznivému bezpečnostnímu profilu. Charakterizace kapidních proteoform VP1, VP2 a VP3 je zásadní pro ověření kvality, bezpečnosti a funkčnosti rekombinantních AAV vektorů. Top-down hmotnostní spektrometrie umožňuje analýzu intact proteoform včetně přímé lokalizace posttranslačních modifikací (PTM).

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo:

• Demonstrace přínosu využití více komplementárních technik disociace (EThcD, HCD, UVPD) na Orbitrap Ascend Tribrid MS.
• Zvýšení sekvenčního pokrytí a přesná lokalizace fosforylací na AAV6 kapidních proteinech VP2 a potvrzení sekvence truncovaného VP3 clip.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky AAV6 exprimované v line HEK293 byly buffer exchange a koncentrace v prostředí 80 % H₂O/20 % acetonitril s 5 mM TCEP a 0,1 % kyseliny mravenčí. UHPLC separace proběhla na Thermo Scientific Vanquish Horizon systému s C4 kolonou (1 × 100 mm, 300 Å, 1,7 µm) při 80 °C, 50 µl/min, rozpouštědla A (H₂O, 0,1 % DFA) a B (acetonitril, 0,1 % DFA). MS analýzu zajišťoval Orbitrap Ascend Tribrid s ESI (3 500 V, 320 °C kapilára, 125 °C vaporizér), nastavení intactního skenu (800–5 000 m/z, rozlišení 15 000), a top-down MS2: EThcD (8 ms, reagent target 7E5, SA CE 15 %), HCD (CE 25 %), UVPD (25 jednotek). Data zpracováno v BioPharma Finder 5.1.

Hlavní výsledky a diskuse

• Intakt analýza odhalila dvě fosforylované proteoformy VP2 (+1 a +2 fosforylace) a truncovaný VP3 clip.
• Targeted top-down MS s izolací 6 amu umožnil paralelní analýzu VP2 fosfo-proteoform a VP3 clip.
• Fosforylace na Ser-11 a Thr-56 byly jednoznačně lokalizovány pomocí fragment iontů c, b a y z EThcD, HCD a UVPD.
• Kombinací fragmentů z jednotlivých metod se sekvenční pokrytí VP2 zvýšilo z 11–22 % na 45–50 %.
• Pro VP3 clip se sekvenční pokrytí zvýšilo ze 13 % (pouze HCD) na 65 % při kombinaci tří metod.

Přínosy a praktické využití metody

• Spolehlivá lokalizace PTM a potvrzení sekvence intactních proteoform.
• Zvýšená citlivost a rozsah sekvenční detekce nízkoabundantních kapidních proteinů.
• Rychlá a robustní top-down LC-MS analýza vhodná pro QA/QC genových vektorů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší integrace více disociačních technik do standardních QC protokolů genové terapie. Další rozvoj automatizovaných workflow a AI-poháněných softwarových nástrojů umožní rychlejší a přesnější interpretaci komplexních proteoform. Rozšiřování metodiky na další serotypy AAV a jiné virové vektory přispěje k optimalizaci genové terapie.

Závěr

Multiplexní top-down MS na Orbitrap Ascend Tribrid významně zvyšuje sekvenční pokrytí a spolehlivou lokalizaci PTM na AAV kapidních proteinech. Přístup umožňuje detailní charakterizaci nízkoabundantních proteoform, čímž podporuje kvalitu a bezpečnost genových vektorů v klinickém i komerčním využití.

Reference

• Samulski RJ, Muzyczka N. AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes. Annu Rev Virol. 2014;1(1):427–451.
• Naso MF, Tomkowicz B, Perry WL, Stroh WR. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. BioDrugs. 2017;31:317–334.
• Dong B et al. Proteomics Analysis of Co-Purifying Cellular Proteins Associated with rAAV Vectors. PLOS ONE. 2014;9(2).
• Popa-Wagner R et al. Impact of VP1-Specific Protein Sequence Motifs on AAV2 Intracellular Trafficking. J Virol. 2012;86(17):9163–9174.
• Van Vliet KM et al. The Role of the AAV Capsid in Gene Transfer. Methods Mol Biol. 2008;437:51–91.
• FDA. Chemistry, Manufacturing, and Control Information for Human Gene Therapy INDs; Guidance for Industry.
• Jin X et al. Direct LC/MS Analysis for Characterization of Recombinant AAV Capsid Proteins. Hum Gene Ther Methods. 2017;28(5):255–267.
• Liu AP et al. Characterization of AAV Capsid Proteins Using HILIC-MS. J Pharm Biomed Anal. 2020;189:113481.
• Kiyonami R et al. Highly sensitive intact mass analysis of AAV capsid proteins using UHPLC-FLD-HRAM MS. Thermo Fisher Sci App Note 000253.
• Kiyonami R et al. AAV capsid protein characterization and HCP profiling using micro-flow UHPLC-Orbitrap MS. App Note 000242.
• Thermo Fisher Scientific. Orbitrap Ascend Tribrid mass spectrometer.
• Thermo Fisher Scientific. Gene Therapy Analysis.
• Srzentić K et al. Characterization of AAV assemblies on UHMR hybrid Q-Orbitrap MS. ASMS 2021 Poster 66125.