Synthetic modified oligonucleotides analysis using a matrix-assisted laser desorption/ionization digital-ion-trap mass spectrometer (MALDI-DIT-MS)

Význam tématu

Analýza synteticky modifikovaných oligonukleotidů je klíčová pro vývoj a kontrolu nových terapeutických látek. MALDI-DIT-MS nabízí rychlý a citlivý přístup k určení molekulové hmotnosti, sekvenční analýze i detekci modifikací včetně GalNAc terminálních vazeb.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři představili jednoduchou a rychlou metodu pro charakterizaci jednovláknových DNA/RNA navozených modifikacemi i dvouvláknové RNA. Cílem bylo ukázat schopnost jediného MALDI-DIT-MS systému provádět:

• určení molekulové hmotnosti (MW) oligonukleotidů,
• sekvenční analýzu včetně lokalizace modifikovaných nukleotidů,
• detekci cílících molekul s triantennárním GalNAc motifem.

Použitá metodika

Vzorky analyzovaných modelů (mipomersen, patisiran, vutrisiran) byly připraveny smísením roztoků analyzátu s matricí 3-HPA, 2,4-DHAP nebo 2,4,6-THAP v acetonitril/voda s kyselinou citronovou. Zpracování probíhalo v pozitivním módu MALDI s rasterovým skenem. Sekvenční analýza využívala multi­stupňový (MSn) rozpad k fragmentaci řetězců a identifikaci modifikací.

Použitá instrumentace

Instrument MALDIminiTM-1 (Shimadzu Corporation) vybavený digitálním iontovým pastí byl provozován s následujícími podmínkami:

• Detektorové napětí 1300–1800 V (závislé na módu),
• Dynodové napětí 7000–8000 V,
• RF zpoždění 17–80 ms podle typu analýzy,
• Rasterový sken v pozitivním módu.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vysokou citlivost ve všech testovaných režimech:

• Jednovláknová DNA (mipomersen) i RNA (patisiran) byla detekována jako [M+H]+ s intenzitou přes 50 %.
• Dvouvláknová RNA (vutrisiran) vykázala signály [M+H]+ a vícení iontů [M+2H]2+, [2M+3H]3+ s dostatečnou intenzitou pro sekvenční analýzu.
• Sekvenční MSn odhalila pozici 2′-O-alkyl, fluoro­modifikací i GalNAc terminálních jednotek (rozdíl 203 Da) pomocí charakteristických fragmentů.

Přínosy a praktické využití metody

MALDI-DIT-MS přináší výrazné zrychlení a zjednodušení analýzy terapeutických oligonukleotidů v porovnání s LC-MS:

• žádná chromatografie,
• minimální příprava vzorku,
• schopnost kombinovat MW screening a sekvenční mapování ve stejném přístroji,
• aplikace v biomedicínském výzkumu, vývoji léků i QA/QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření MALDI-DIT-MS do rutinní kontroly kvality oligonukleotidových léčiv, rozvoj softwaru pro automatizovanou interpretaci sekvenčních dat a integrace s iontovými mobilitními technikami. Kombinace s dalšími modulárními doplňky umožní hlubší pohled na strukturu a stabilitu RNA/DNA komplexů.

Závěr

Studie potvrzuje, že jediný MALDI-DIT-MS systém umožňuje komplexní analýzu syntetických modifikovaných oligonukleotidů – od určení molekulové hmotnosti přes lokalizaci modifikací až po detekci glykovaných konců. Metoda slibuje široké využití ve farmaceutickém výzkumu i průmyslové praxi.

Reference

1. McLuckey SA, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 1992, 3, 60–70.