Ultrafast Plasma Protein Binding Analysis

Význam tématu

Plasma protein binding (PPB) je klíčovým parametrem farmakokinetiky a farmakodynamiky léčiv. Podíl léčiv vázaných na plazmatické proteiny ovlivňuje jejich volnou, biologicky aktivní frakci, distribuci a clearance. Vyšší propustnost metod in vitro umožňuje rychlejší optimalizaci kandidátů na léčiva v raných fázích vývoje.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout jedinou, ultrarychlou metodu stanovení PPB založenou na systému Agilent RapidFire High-Throughput MS spojeném s vysokorozlišovacím Q-TOF detektorem. Metoda byla srovnána s referenčním LC-MRM/MS přístupem z hlediska přesnosti, rychlosti a shody výsledků.

Použitá instrumentace

• RapidFire 360 High-Throughput Mass Spectrometry system
• Agilent 6550 iFunnel Q-TOF Mass Spectrometer
• Agilent 1260 Infinity Binary LC system
• Agilent 6460 Triple Quadrupole Mass Spectrometer
• Rapid Equilibrium Dialysis (RED) zařízení

Použitá metodika

Vzorky lidské plazmy byly připraveny rapidní dialýzou (RED) po 5 h inkubace při 37 °C a následně sráženy ledovou acetonitrilovou směsí s interním standardem. Pro LC/MS/MS byl použit MRM režim s chromatografickou separací trvající 2 minuty na C18 sloupci. Pro ultrarychlou metodu SPE/TOF/MS stačilo 9 s na vzorek, kdy se vzorky automaticky zpracovávaly na SPE cartridgi s reverzní fází C18 a analyzovaly pomocí přesné hmotnostní analýzy (10 ppm).

Hlavní výsledky a diskuse

Do testu bylo zařazeno více než 40 sloučenin s molekulovou hmotností 160–733 Da a rozsáhlým rozsahem lipofilicity (xLogP –0,4 až 7,1). Metoda SPE/TOF/MS dosáhla průtoku 400 vzorků/h oproti 20 vzorkům/h u LC/MS/MS. Procento vázání zjištěné oběma metodami vykázalo vynikající korelaci (R2 = 0,977). Výsledky byly ve shodě s literárními hodnotami PPB a nepotřebovaly specifický MRM vývoj metodiky pro jednotlivé sloučeniny.

Přínosy a praktické využití metody

• Desetinásobné zvýšení rychlosti analýzy oproti konvenčnímu LC/MS/MS
• Eliminace časově náročného vývoje MRM metod pro každou látku
• Vysoká přesnost a věrohodnost výsledků díky vysokému rozlišení Q-TOF
• Snadná integrace do automatizovaných in vitro ADME workflow

Budoucí trendy a možnosti využití

Ultrafast SPE/TOF/MS přístup lze dále rozšířit na další in vitro ADME testy (metabolismus, permeabilita), integrovat miniaturizovaná mikrofluidní řešení a aplikovat ve spojení s umělými inteligencí pro inteligentní plánování experimentů.

Závěr

Vyvinutá metoda ultrarychlého stanovení PPB pomocí Agilent RapidFire SPE/TOF/MS nabízí mimořádnou produktivitu a srovnatelnou přesnost s tradiční LC/MS/MS. Díky vysokorozlišovacímu přístupu a standardnímu workflow bez nutnosti MRM vývoje je vhodná pro vysokoobjemové screeningy v raném vývoji léčiv.

Reference

1. van Liempd S. et al. Development and Validation of a Higher-Throughput Equilibrium Dialysis Assay for Plasma Protein Binding. Journal of the Association for Laboratory Automation 2011, 16(1), 56–67.
2. Waters N. J. et al. Validation of a Rapid Equilibrium Dialysis Approach for the Measurement of Plasma Protein Binding. Journal of Pharmaceutical Sciences 2008, 97(10), 4586–4595.
3. Shanler M. S. et al. Validation of an Automated High Throughput Plasma Protein Binding Assay. BD Biosciences Application Note #474, 2009.