Determination of Carbohydrates in Urine by Capillary HPAE-PAD

Význam tématu

Metoda HPAE-PAD umožňuje přímou detekci neutrálních sacharidů bez nutnosti časově náročné a nákladné derivatizace. Analýza monosacharidů a disacharidů v moči je významná pro posouzení intestinální permeability a monitorování různých onemocnění u lidí i laboratorních zvířat. Přechod na kapilární formát iontové chromatografie (capillary IC) s generátorem eluentu přináší úsporu reagencií, nižší produkci odpadu a možnost nepřetržitého provozu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky bylo prokázat, že separace deseti klíčových sacharidů (mannitol, rhamnosa, xylose, 3-O-methylglukóza, galaktosa, glukosa, ribosa, sacharosa, laktosa, laktulosa) v syntetické moči je možná na kapilárním systému Thermo Scientific Dionex ICS-4000 HPIC s použitím Reagent-Free™ IC a PAD detekce. Studie navazuje na dřívější výsledky na standardní 3 × 150 mm CarboPac PA20 kolóně a demonstruje ekvivalentní výkon při µL/min průtoku.

Použitá metodika a instrumentace

V experimentu se generoval hydroxid eluentu elektrolyticky (RFIC) z deionizované vody. Gradient byl nastaven od 10 do 35 mM KOH při konstantním průtoku 0,008 mL/min. Zahřátá CarboPac PA20 kolona (0,4 × 150 mm) pracovala při 30 °C, komora ED modulu při 27 °C. Injekční objem byl 0,4 µL. Detekce probíhala pomocí pulzní ampérometrie na zlatém pracovní elektrodě na PTFE s čtyřpotenciální vlnou a referenční elektrodou Ag/AgCl. Standardizace se prováděla na 1,67 µg/mL každého sacharidu.

Použitá instrumentace

• Ion chromatografický systém Thermo Scientific Dionex ICS-4000 HPIC
• Reagent-Free™ eluent generator cartridge EGC-KOH (capillary)
• CR-ATC kapilární trap kolona ASTC-500
• Kapilární CarboPac PA20 aniontová kolona (0,4 × 150 mm) s guard kolónou (0,4 × 35 mm)
• Autosampler Dionex AS-AP
• Elektrochemický detektor s PTFE zlatou pracovní elektrodou a pH-Ag/AgCl referencí
• Chromeleon™ 7 CDS software pro řízení metody

Hlavní výsledky a diskuse

Na kapilárním systému se v čase do 16 minut separovalo deset sacharidů s rozlišením kritických párů 3-O-methylglukóza/rhamnosa a laktóza/laktulosa obdobně jako na 3 mm verzi kolony. Porovnání chromatogramů v deionizované vodě a syntetické moči ukázalo totožné retenční časy a stabilní základní linii; vysoký obsah solí v moči neovlivnil separaci ani nepřetížil kolonu. Spotřeba eluentu byla snížena na 15 mL/den, přičemž cartridges pro eluent generator vydržely až 18 měsíců.

Přínosy a praktické využití metody

• Přímé stanovení bez derivatizace – úspora času a nákladů na reagencie
• Vysoká citlivost (pmol úroveň)
• Minimalizace odpadu a nízká spotřeba eluentu
• Možnost nonstop provozu a vysoká vzorková průchodnost
• Vysoká robustnost kapilárního systému při tlacích do 5000 psi

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikací na stanovení sialových kyselin v glykopeptidech, integrace kapilární IC s hmotnostní spektrometrií pro komplexní analýzy, využití microfluidických platforem a plná automatizace workflow pro klinické a průmyslové nasazení.

Závěr

Studie prokázala, že kapilární HPAE-PAD na Dionex ICS-4000 HPIC je spolehlivá a vysoce citlivá metoda pro stanovení sacharidů v moči. Metoda kombinuje rychlou separaci, nízké provozní náklady a dlouhodobou stabilitu, což ji činí vhodnou pro rutinní analýzy v biomedicínském výzkumu i QA/QC laboratořích.

Reference

1. Hurum D.; Rohrer J. Determination of Carbohydrates in Urine by HPAE-PAD. Thermo Scientific AN1006, 2012.
2. Kynaston J.A.; Fleming S.C.; Laker M.F.; Pearson A.D.J. Clin. Chem. 1993, 39, 453–456.
3. Peelen G.O.H.; de Jong J.G.N.; Wevers R.A. Clin. Chem. 1994, 40, 914–921.
4. Buhner S.; Buning C.; Genschel J. et al. Gut 2006, 55, 342–347.
5. Sorensen S.H.; Proud J.F.; Rutgers H.C.; Batt R.M. Clin. Chim. Acta 1993, 221, 115–125.
6. Sorensen S.H.; Proud F.J.; Rutgers H.C.; Markwell P.; Adam A.; Batt R.M. Clin. Chim. Acta 1997, 264, 103–115.
7. Kotnik D.; Smidovnik A.; Jazbec-Krizman P.; Krizman M.; Prosek M. J. Chromatogr. B 2011, 879, 3700–3706.
8. Playford R.J.; MacDonald C.E.; Calnan D.P. et al. Clin. Sci. 2001, 100, 627–633.
9. Bao Y.; Silva T.M.J.; Guerrant R.L.; Lima A.A.M.; Fox J.W. J. Chromatogr. B 1996, 685, 105–112.
10. Barboza M.S.; Silva T.M.J.; Guerrant R.L.; Lima A.A.M. Br. J. Med. Biol. Res. 1999, 32, 1499–1504.
11. Doig C.J.; Sutherland L.R.; Sandham J.D. et al. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998, 158, 444–451.
12. Smecuol E.; Bai J.C.; Sugai E. et al. Gut 2001, 49, 650–655.
13. Thermo Fisher Scientific. TN 136: Configuring a High-Pressure Dedicated Capillary IC System for Electrochemical Detection, 2013.
14. Thermo Fisher Scientific. Dionex ICS-4000 Operator’s Manual, 2013.
15. Thermo Fisher Scientific. Dionex AS-AP Operator’s Manual, 2012.
16. Thermo Fisher Scientific. Product Manual for the Continuously Regenerated Trap Column CR-TC, 2010.
17. Thermo Fisher Scientific. Eluent Generator Cartridge Product Manual, 2012.
18. Thermo Fisher Scientific. Technical Note 113: Practical Guidance for Capillary IC, 2012.
19. Thermo Fisher Scientific. ED User’s Compendium for Electrochemical Detection, 2010.
20. Thermo Fisher Scientific. TN 110: Carbohydrate Determination by HPAE-PAD with Disposable Gold on PTFE Electrodes, 2011.
21. Thermo Fisher Scientific. Application Update 141: Improved Stability of Sialic Acid Peak Responses, 2000.
22. Thermo Fisher Scientific. Application Update AU 180: Direct Determination of Sialic Acids in Glycoprotein Hydrolyzates by HPAE-PAD, 2011.
23. Thermo Fisher Scientific. Application Update AU 181: Rapid Screening of Sialic Acids in Glycoproteins by HPAE-PAD, 2011.