Complementary analysis in a biopharmaceutical research laboratory with a 2D-LC-MS instrument for flexible operation

Význam tématu

Analýza bioterapeutik, zejména proteinových léčiv, vyžaduje vysoké rozlišení a selektivitu k identifikaci stopových nečistot a modifikací. Dvousouřadnicová kapalinová chromatografie (2D-LC) v kombinaci s hmotnostní spektrometrií umožňuje efektivní oddělení komplexních směsí makromolekul, zlepšuje spolehlivost a prohlubuje charakterizaci terapeutických proteinů.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo potvrzení identity a přiřazení proteinových nečistot terapeutického proteinu (~25 kDa) pomocí online multi heart-cut 2D-LC-MS v top-down experimentu. Studie demonstruje flexibilní využití jednoho přístrojového uspořádání pro 2D-LC-MS, standardní 1D-LC-MS a duální 1D-LC-UV měření bez mechanických úprav.

Použitá metodika a instrumentace

Proteinový vzorek byl redukován DTT v pufru amonného hydrogenuhličitanu (pH 8) a analyzován bez dalšího čištění.

Chromatografické módy:

• 1D: RP-LC s TFA na C18 kolonce Waters Acquity UPLC Peptide BEH C18 (2,1×50 mm, 1,7 μm).
• 2D: izokratická SEC na Tosoh UP-SW2000 (4,6×150 mm, 2,0 μm) pro odstranění TFA.

Mobilní fáze a průtok:

• 1D: voda/TFA a acetonitril/TFA, gradient 50→70 % B, 0,6 mL/min.
• 2D: voda/FA a acetonitril/FA, 35 % B, 0,35 mL/min.

Instrumentace:

• Vanquish Horizon Simple Switch 2D-LC systém s multi-heart-cut ventily a smyčkami (50 μL, 250 μL).
• Vanquish Duo for Dual LC (dva nezávislé 1D průtokové okruhy).
• Orbitrap Fusion Tribrid MS pro top-down fragmentaci (HCD, CID, ETD).
• Diodový array detektor a UV detekce (215, 280 nm) pro kontrolu 1D separací.

Hlavní výsledky a diskuse

1D RP-LC stabilně rozlišila hlavní protein a dvě neznámé nečistoty. Multi-heart-cut proces převedl špičky do smyček, které byly následně separovány v 2D SEC a analyzovány MS. Top-down fragmentace generovala sekvenční pokrytí ~55 % a ~45 % pro dvě frakce, čímž byly potvrzeny modifikace a identita nečistot. Flexibilní přepínání mezi 2D-LC-MS, 1D-LC-MS a duálním 1D-LC-UV snížilo dobu přepojování a maximalizovalo využití hmotnostního spektrometru.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoké rozlišení a selektivita pro komplexní proteinové směsi.
• Odstranění rušivých modifierů (TFA) v druhé dimenzi.
• Rychlá změna provozního módu bez mechanických zásahů.
• Úspora prostoru a investičních nákladů díky jednomu univerzálnímu přístroji.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směřování zahrnuje širší standardizaci 2D-LC-MS v rutinních laboratořích, integraci s pokročilou datovou analýzou a strojovým učením pro automatickou interpretaci spekter, rozvoj čištění online a rozšíření nových separačních módů (ion-exchange, HILIC) ve dvousouřadnicových protokolech.

Závěr

Popisovaný přístup ukázal efektivní kombinaci RP-LC a SEC v multi-heart-cut 2D-LC-MS pro detailní charakterizaci proteinových nečistot. Díky technologii Simple Switch lze snadno přepínat mezi 2D-LC-MS a 1D aplikacemi, což zvyšuje flexibilitu a návratnost investice v biopharmaceutických laboratořích.

Reference

1. Pirok, B. W. J.; Stoll, D. R.; Schoenmakers, P. J. Anal Chem 2019, 91(1), 240–263.
2. Stoll, D. R.; Maloney, T. D. LCGC North America 2017, 35(9), 680–687.
3. Grübner, M.; Greco, G. Thermo Fisher Scientific Technical Note 73298, 2019.
4. Grübner, M.; Steiner, F. Thermo Fisher Scientific Technical Note 73184, 2019.
5. McGillicuddy, N. et al. Thermo Fisher Scientific Application Note 72599.