Complementary analysis in a biopharmaceutical research laboratory with a 2D-LC-MS instrument for flexible operation

Význam tématu

Analyzování proteinových terapeutik vyžaduje vysoké rozlišení a spolehlivou identifikaci stopových nečistot. Dvoudimenzionální kapalinová chromatografie v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (2D-LC-MS) významně zlepšuje selektivitu a citlivost při charakterizaci složitých biopolymerních vzorků.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo ověřit identitu a strukturu proteinových nečistot (~25 kDa) v biotechnologickém preparátu pomocí top-down 2D-LC-MS s vícenásobným přenosem („multi heart-cut“) mezi první (RP-LC) a druhou (SEC) dimenzí. Studie dále demonstruje flexibilní provoz přístroje Vanquish Simple Switch 2D-LC MS bez nutnosti přepojování linek.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: redukovaný terapeutický protein ve 25 mM amonném hydrogenuhličitanu (pH 8) s DTT.
Chromatografie první dimenze: RP-LC na kolóně Waters Acquity UPLC Peptide BEH C18 (2,1×50 mm, 1,7 μm) s gradientem TFA/voda–TFA/acetonitril, průtok 0,6 mL/min, 40 °C.
Chromatografie druhé dimenze: izokratická SEC na kolóně Tosoh UP-SW2000 (4,6×150 mm, 2,0 μm) s modifikátorem FA, průtok 0,35 mL/min, 25 °C.
Interface: Thermo Scientific Vanquish Horizon Simple Switch 2D-LC systém s MP35N smyčkami (3×50 μL, 3×250 μL) a Vanquish Duo for Dual LC samplers.
Spektrometrie: Orbitrap Fusion Tribrid, top-down MS/MS (HCD, CID, ETD), izolační okno 600 m/z, rozlišení 60 000, 20 microscany.
Software: Chromeleon CDS 7.2.9 pro LC-UV a řízení 2D-LC, Xcalibur 4.3 pro MS, BioPharma Finder 4.1 pro MS analýzu.

Hlavní výsledky a diskuse

1D chromatogram při opakovaných injekcích prokázal výbornou reprodukovatelnost (28,5 µg vzorku). Dva klíčové impuritní špičky byly vyřezány do smyček a následně separovány SEC jako TFA-odstraňovací krok. Top-down fragmentace poskytla sekvenační pokrytí až 55 % u první frakce a 45 % u druhé, potvrzující modifikace a strukturu detekovaných nečistot. Použití TFA v RP-LC bylo kompenzováno jeho odstraněním v 2D, čímž se minimalizovalo potlačení signálu v ESI-MS.

Přínosy a praktické využití metody

• Efektivní identifikace a potvrdění proteinových nečistot v top-down experimentu bez nutnosti separátního čistícího kroku.
• Maximální využití zařízení díky Simple Switch technologii – přepínání mezi 2D-LC-MS, 1D-LC-MS a duálním 1D-LC-UV provozem bez mechanických úprav.
• Zrychlený vývoj a validace metod v biopharma výzkumu, úspora laboratorního prostoru a investičního kapitálu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikací na analýzu konjugovaných monoklonálních protilátek (ADC), oligonukleotidů a dalších složitých biopolymerů.
• Integrace dalších separačních modů (ion-exchange, hydrophobic interaction) do 2D-LC-MS workflow pro komplexní proteomické a biomedicínské studie.
• Automatizace a inteligentní plánování frakcí na základě živé datové analýzy pro zvýšení throughput a robustnosti metod.

Závěr

Multi heart-cut 2D-LC-MS na platformě Vanquish Simple Switch umožňuje spolehlivou charakterizaci proteinových nečistot v top-down režimu. Flexibilita provozu zvyšuje využití přístroje a zkracuje dobu vývoje analytických metod bez kompromisu na kvalitě dat.

Reference

1. Pirok B. W. J.; Stoll D. R.; Schoenmakers P. J. Recent developments in two-dimensional liquid chromatography: Fundamental improvements for practical applications. Anal Chem 2019, 91(1), 240–263.
2. Stoll D. R.; Maloney T. D. Recent Advances in Two-Dimensional Liquid Chromatography for Pharmaceutical and Biopharmaceutical Analysis. LCGC North America 2017, 35(9), 680–687.
3. Grübner M.; Greco G. Flexible HPLC instrument setups for double usage as one heart-cut 2D-LC system or two independent 1D-LC systems. Thermo Fisher Sci. Tech. Note 73298, 2019.
4. Grübner M.; Steiner F. Complementary Dual LC as a convenient alternative to multiple heart-cut 2D-LC. Thermo Fisher Sci. Tech. Note 73184, 2019.
5. McGillicuddy N. et al. Simultaneous analysis of monoclonal antibodies using a novel dual-channel UHPLC instrument. Thermo Fisher Sci. App. Note 72599.