Novel tandem nano and capillary flow LC-MS-based approach for facile 24/7 proteome profiling with near 100% MS utilization

Význam tématu

V proteomické analýze hraje nano- a kapilární LC-MS klíčovou roli díky své vysoké citlivosti a schopnosti detailního mapování komplexních proteinových vzorků. Tradiční přímá injekční workflow však trpí nízkou využitelností MS kvůli časově náročným krokům, jako je vkládání vzorku, mytí, ekvilibrace a transport analytů na MS detektor. Eliminace těchto „overhead“ fází je zásadní pro zvýšení propustnosti a efektivity laboratoří zaměřených na rozsáhlé proteomické studie.

Cíle a přehled studie

Autoři představují nový tandem direct injection přístup na systému Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC spojený s Orbitrap Exploris 480 MS. Cílem bylo maximalizovat využití hmotnostního spektrometru při nano- a kapilárních průtocích (≤5 µl/min) pro 24/7 provoz s blízko 100% MS využitelností, přičemž se zachová vysoké chromatografické rozlišení a reprodukovatelnost.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow využívá dvě oddělené analytické kolony, které se střídají v režimu „look-ahead“ injekcí a inteligentního přepínání:

• Vanquish Neo UHPLC se separačním čerpadlem a binárním čerpadlem N
• Vanquish Column Compartment N s nízkodisperzním přepínačem (2p-6p valve)
• Double Barrel Column Oven (Sonation GmbH) pro simultánní provoz dvou kolon
• Nanospray Flex Ion Source s dvojitou tryskou pro ESI
• Orbitrap Exploris 480 Mass Spectrometer
• Fingertight nanoViper fittings pro optimální spojení kapilár

Metoda kombinuje načítání, mytí a ekvilibraci jedné kolony, zatímco na druhé probíhá vlastní gradientní eluce, čímž se minimalizuje nevyužitý čas.

Hlavní výsledky a diskuse

V testech s HeLa peptidovým standardem dosáhl tandemní přístup MS využití 94 % při 65min gradientu (0,3 µl/min) a 79 % při 8min gradientu (1,5 µl/min). Rozdíl v retenčních časech mezi dvěma kolony byl menší než 0,5 min, což potvrzuje vynikající reprodukovatelnost retence a plošného signálu. Celodenní provoz umožňuje zpracovat až 180 vzorků za den při vysoké hloubce proteomu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Maximální využití instrumentu a vyšší propustnost vzorků
• Vysokou citlivost typickou pro nano-LC
• Flexibilitu přizpůsobení gradientu i pro specifické aplikace (např. fosfoproteomika, TMT-značení)
• Snížené carry-over díky optimalizovaným cyklům mytí a ekvilibrace
• Možnost nepřetržitého provozu 24/7 bez manuálních zásahů

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj lze očekávat v oblasti automatizovaného plánování a adaptivních metod, které upravují podmínky separace v reálném čase podle složení vzorku. Integrace s cílenými proteomickými přístupy, single-cell analýzou či rozšíření na další MS platformy slibuje další zvýšení výkonu a hloubky analýzy.

Závěr

Nový tandem direct injection workflow na systému Vanquish Neo spojený s Orbitrap Exploris 480 nabízí revoluční kombinaci vysoké citlivosti nano-LC a maximálního využití MS přístroje. Výsledkem je robustní, vysoce reprodukovatelná procedura pro hlubokou a rychlou proteomickou analýzu za neustálého provozu.

Reference

1. R. Zheng, C. Pynn, et al. New Double Barrel ESI Source and Novel Tandem NanoLC-MS for 24/7 Proteome Profiling with near 100% MS Utilization. TN 73671, Thermo Scientific.
2. A. Boychenko, C. Pynn, et al. High-throughput tandem capillary-flow LC-MS for maximum MS utilization. TN 72827, Thermo Scientific.