From HPLC to UHPLC: Method Transfer, What Should I Pay Attention to?

Význam tématu

V přechodu z konvenční HPLC na ultrarychlou UHPLC hrají klíčovou roli faktory spojené s objemem zpoždění gradientu a řízením teploty. Správná metodika přenosu zajišťuje konzistentní retenční časy, optimální oddělení a reprodukovatelnost výsledků. Porozumění rozdílům mezi systémy a jejich nástrojovými vlastnostmi umožňuje zkrátit dobu analýzy, zvýšit rozlišení a zlepšit robustnost metody.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřuje na identifikaci a kvantifikaci klíčových parametrů ovlivňujících přenos metody z HPLC na UHPLC. Konkrétně hodnotí:

• Gradientní zpožďovací objem (GDV) v poměru k objemu kolony.
• Vliv rozdílné fluidiky a délky potrubí na retenční chování gradientních a izokratických kroků.
• Role termostatování kolony – porovnání režimů nucené a pasivní cirkulace vzduchu.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika spočívala v měření GDV u dvou srovnávaných UHPLC systémů a úpravě programů gradientu tak, aby se minimalizovaly rozdíly v počáteční izokratické části. Byly použity následující přístroje:

• Thermo Scientific™ Vanquish™ Horizon UHPLC System
• Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex System
• Thermo Scientific™ UltiMate™ 3000 (Bio)RS System
• Kapiláry Viper™ a volitelná regulační zařízení objemu v autosampleru pro jemné dolaďování GDV
• Kolony Hypersil GOLD™ (1,9 µm) a Accucore Vanquish™ C18 (1,5 µm)
• Předehřívače eluenty a komory kolony se dvěma termostatovacími koncepty: nucená cirkulace a pasivní (still air)

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo prokázáno, že rozdíly ve velikosti GDV se promítají do délky izokratické fáze na začátku gradientu a ovlivňují zejména slabě zadržované analyty. Doporučené přístupy:

• Při menším GDV přidat v programu kauzální izokratický krok.
• Při větším GDV zkrátit délku potrubí anebo použít úzké mikrokapiláry.

Termostatování:

• Pasivní režim (still air) zachovává vzniklé teplo uvnitř kolony, vede k vyšší účinnosti a ostřejším vrcholům, může však měnit selektivitu kvůli radiálnímu gradientu teploty.
• Nucená cirkulace (forced air) účinně odvádí třecí teplo, minimalizuje přehřívání kolony, avšak může zhoršit rozlišení u kritických párů špiček.
• Variabilní rychlost ventilátoru umožňuje kombinovat výhody obou režimů a jemně optimalizovat rozlišení či selektivitu.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaný přenos metody mezi HPLC a UHPLC přináší:

• Reprodukovatelné retenční časy napříč laboratořemi a platformami.
• Možnost zkrácení doby analýzy díky rychlejším gradientům a menšímu objemu GDV.
• Zvýšenou robustnost metodiky díky automatizované regulaci GDV v autosampleru.
• Lepší kontrolu účinnosti a selektivity pomocí volby termostatovacího režimu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj směřuje k plné automatizaci přenosu metod, využití umělé inteligence pro predikci optimálních nastavení GDV a teploty a k dalšímu zmenšování vnitřních objemů systémů. Mikrofluidní komponenty a pokročilá softwarová řešení umožní rychlejší vývoj nových analýz a vyšší škálovatelnost pro kyberneticky řízené laboratoře.

Závěr

Pro úspěšný přenos metod z HPLC na UHPLC je zásadní znát poměr GDV k objemu kolony a správně zvolit termostatovací režim. Moderní UHPLC systémy umožňují automatizované doladění objemu gradientu i tepelné správy a poskytují flexibilitu potřebnou k dosažení vysokého rozlišení a reprodukovatelnosti.

Reference

Žádné explicitně uvedené reference v původním textu.