Quantifying Oligonucleotide Deamination with Multi-Reflecting Time-of-Flight Mass Spectrometry

Význam tématu

Syntetické oligonukleotidy představují stále významnější kategorii léčivých molekul. Deaminace cytosinových zbytků vede k nežádoucím úpravám sekvence, které mohou snížit účinnost a zvýšit riziko mimovolného působení. Citlivé a selektivní metody pro detekci těchto nízkoúrovňových degradací jsou proto zásadní pro zajištění kvality, bezpečnosti a stability oligonukleotidové léčby.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyvinout a ověřit dvě komplementární strategie pro kvantifikaci deaminačních produktů v antisense oligonukleotidu 23 mer: metodu analýzy izotopové distribuce (IDF) a MS/MS fragmentační přístup. Klíčovým požadavkem bylo dosažení detekce pod úrovní 1,5 % nečistoty s rychlou a opakovatelnou analýzou.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: 23mer antisense oligonukleotid (FLP) a deaminovaný impuritní standard spikovaný ve výškách od 0,1 % do 10 % při celkové koncentraci 0,1 mg/mL.
• Chromatografie: Waters ACQUITY Premier UPLC, kolona OST 1,7 µm 2,1×50 mm, gradientní metoda 6 min, průtok 50 µL/min, 4 µL injekce.
• Hmotnostní spektrometrie: Waters Xevo MRT, ESI v negativním režimu, rozlišení 100 000 FWHM, rozsah m/z 50–4000.
• MS/MS fragmentace: kolísání kolizní energie 10–30 V, selekce iontového státu [M−10H]10− m/z 733.
• Analýza izotopové distribuce: kolizní energie 6 V pro IDF, výpočet z výšek izotopových pí­ků P7–P12 vůči P1–P5.
• Software: UNIFI Application pro akvizici, CONFIRM Sequence pro fragmentační data.

Hlavní výsledky a diskuse

• MS/MS fragmentační metoda umožnila lokalizovat deaminaci na druhé pozici sekvence pomocí fragmentu b2 (dG* dU* m/z 572,09) a rozlišit jej od 13C izotopu původního fragmentu (m/z 572,11).
• Metoda IDF založená na drobných posunech izotopového obálky prokázala vynikající linearitu v rozsahu 0,1–10 % (R2 = 0,998) a opakovatelnost (pět replikátů) při desetinásobně nižších náročnostech vzorku než v předchozích studiích.
• Kombinace krátké 6minutové LC metody a rychlého zpracování umožnila kompletní analýzu 15 injekcí během méně než 2 hodin.

Přínosy a praktické využití metody

• Detekce deaminačních nečistot pod 0,5 % s vysokou přesností.
• Rychlé workflow (3–6 min na vzorek) vhodné pro vysokopropustné laboratorní provozy.
• Orthogonální přístup: izotopová distribuce pro globální kvantifikaci a MS/MS pro potvrzení a lokalizaci modifikací.
• Integrované řešení pro vývoj i rutinní kontrolu kvality oligonukleotidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další automatizace a miniaturizace LC-MS narázových metod pro oligonukleotidy.
• Integrace pokročilých algoritmů strojového učení pro automatickou detekci a kvantifikaci modifikací.
• Rozšíření metodiky na širší třídy bazálních a chemických modifikací oligonukleotidů.
• Využití v klinické a regulátorní praxi pro rychlou validaci stability nových terapeutik.

Závěr

Dvě komplementární strategie – MS/MS fragmentace a IDF izotopové analýzy – poskytují robustní, citlivé a rychlé řešení pro monitorování deaminace oligonukleotidů. Metody nabízí vysokou propustnost, vynikající opakovatelnost a lineární kvantifikaci v rozsahu 0,1–10 %, což výrazně přispívá ke kvalitní kontrole a vývoji oligonukleotidových terapeutik.

Reference

1. Capaldi DC. Stress Testing of Oligonucleotides. In: Baertski SW, Alsante KM, Reed RA, editoři. Pharmaceutical Stress Testing. 2nd ed. Informa Healthcare; 2011:391–425.
2. ICH Q1A(R2). Stability Testing of New Drug Substances and Products. 2003.
3. Rentel C, DaCosta J, Roussis S, Chan J, Capaldi DC, Mai B. Quantification of Oligonucleotide Deamination via Isotopic Distribution Factors. J Pharm Biomed Anal. 2019;173:56–61.