Light Scattering and Size Exclusion Chromatography (SEC) in Biopharma

Význam tématu

Size exclusion chromatography (SEC) s detekcí rozptylem světla představuje klíčovou metodu pro charakterizaci molekulární hmotnosti, rozměrů a konformace biopolymerů v biopharmaceutickém odvětví. Díky možnosti přímého měření bez závislosti na kalibrantech usnadňuje kontrolu kvality, sledování agregace a přesné stanovení kritických parametrů, jako je poměr drogy k protilátce u ADC.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem white paperu je představit teoretická východiska a praktickou aplikaci detekce rozptylem světla v SEC pro biopharmaceutické vzorky. Dokument popisuje jak statickou (SLS), tak dynamickou (DLS) metodu, demonstruje jejich nasazení na vybraných modelech (polystyren, PMMA, proteinové léky, mAb, BSA, thyroglobulin) a ukazuje výhody kombinovaného měření.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika spočívá v online měření frakcí elujících z SEC kolony pomocí 20úhlového statického a dvouúhlového dynamického detektoru:

• Agilent InfinityLab GPC/SEC Solutions
• Agilent 1260 Infinity II Multi-Angle Light Scattering Detector (12°–164°)
• Agilent 1260 Infinity II Bio-SEC Multidetector System s DLS detektorem (15° a 90°)
• WinGPC Software pro Zimmovy a cumulantní analýzy
• Agilent PROTEEMA 300 Å, 5 µm analytické kolony, mAb SiO2 3 µm kolony

Hlavní výsledky a diskuse

Statické měření umožnilo přesné stanovení Mw protilátek (147 kDa u bevacizumabu, odchylka cca 1 %) a vyčíslení poloměru gyrace (Rg 10–16 nm). Dynamické měření poskytlo hydrodynamické poloměry (RH 4–14 nm) a detekci agregátů BSA a IgG. Kombinace SLS a DLS odhalila topologii (ρ-poměr) od homogenních sfér po náhodné polyelektrolyty. Ukázalo se, že měření při nízkých uhlech potlačuje interferenci větších částic, zatímco vysoké úhly zlepšují rozlišení konformací.

Přínosy a praktické využití metody

Online kombinované měření SLS/DLS v SEC

• umožňuje kalibraci sloupce bez standardů,
• určuje absolutní molekulární hmotnost i rozměry frakcí,
• detekuje agregáty a degradační produkty,
• podporuje kontrolu kvality (QA/QC) biologických léčiv a vakcín,
• pomáhá optimalizovat výrobu a stabilitu biokonjugátů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj bude směřovat k miniaturizaci a vyšší propustnosti metod (microflow SEC), integraci s hmotnostní spektrometrií, zlepšení softwarových algoritmů pro rychlejší a automatizované zpracování, a rozšíření na nové typy vzorků (LNP, AAV, exozomy). Moderní detektory s širším rozsahem úhlů a vlnových délek zvýší citlivost i při nízkých koncentracích.

Závěr

Kombinace SEC s detekcí rozptylem světla nabízí výkonný nástroj pro komplexní charakterizaci biopolymerů. Statická a dynamická technika umožňuje přesné měření molekulární hmotnosti, velikosti a topologie v reálném čase. Implementace robustních multiúhlových detektorů a specializovaného softwaru transformuje rutinní analýzu v bioprocesním výzkumu i výrobě.

Reference

1. Fischer K, Schmidt M. Pitfalls and Novel Applications of Particle Sizing by Dynamic Light Scattering. Biomaterials. 2016;98:79–91.
2. Coffey A, Kondaveeti S. An AdvanceBio HIC Column for Drug-to-Antibody Ratio (DAR) Analysis of Antibody Drug Conjugates (ADCs). Agilent Technologies Application Note. 2018;
3. Agilent GPC/SEC Standards home page. 2023.
4. Schärtl W. Light Scattering from Polymer Solutions and Nanoparticle Dispersions. Springer. 2007.
5. Masuelli M, Gassmann J. Advances in Physicochemical Properties of Biopolymers, Part 1. Bentham Science. 2017;
6. Arndt K, Müller G. Polymercharakterisierung. Carl Hanser Verlag. 1996.
7. Hirvonen L et al. Hydrodynamic Radii of Ranibizumab, Aflibercept and Bevacizumab Measured by Time-Resolved Phosphorescence Anisotropy. Pharm Res. 2016;33:2025–2032.