Characterization of nanopharmaceuticals with field-flow fractionation and light scattering (FFF-MALS-DLS)

Význam tématu

Charakterizace nanočástic přináší klíčové informace pro vývoj a kontrolu nanoformulací určených k cílené dodávce léčiv. Přesná analýza velikosti, tvaru, koncentrace a složení je nezbytná pro splnění požadavků regulačních orgánů a pro zajištění bezpečnosti a účinnosti léčiv. Metody založené na polodisperzním dávkování či imaginové analýze často stojí před kompromisy mezi rozlišením, statistickou robustností a náročností přípravy vzorku.

Cíle a přehled studie / článku

• Představit kombinaci asymetrické průtokové frakcionace (FFF) s víceúhlovým rozptylem světla (MALS) a dynamickým rozptylem světla (DLS).
• Ukázat možnosti detailní, kvantitativní analýzy nanočástic v rozsahu 1–1000 nm.
• Ilustrovat přínosy online detekce velikostních a strukturních parametrů na příkladech latexových standardů, virových částic, liposomů a polymérních nosičů.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda asymetrické průtokové frakcionace (AF4) využívá tenký kanál s jednou semipermeabilní stěnou, která odděluje částice od nosného média pomocí laterálního průtoku. Velikostní frakcionace vychází ze vztahu mezi translací difuzí částice a rychlostí proudu. Oddělené frakce postupně procházejí detektory:

• MALS – měření úhlu a intenzity rozptýleného světla poskytuje informace o molární hmotnosti a poloměru otáčivého momentu (Rg).
• DLS – analýza časových fluktuací intenzity světla určuje translaci difuzního koeficientu a hydrodynamický poloměr (Rh).
• Další online detektory (UV/Vis, fluorescenční, diferenční refraktometrie) rozšiřují profil složení a koncentrace.

Použitá instrumentace

• Eclipse™ AF4 systém (řídicí modul, separační kanál).
• DAWN™ MALS detektor (ultraDAWN™ pro procesní analýzu).
• WyattQELS™ DLS modul integrovaný v MALS buňce.
• Optilab™ diferenční refraktometrie a UV/Vis detektory.
• HPLC komponenty pro pufrování a injekci.
• Softwary VISION™ (řízení instrumentu) a ASTRA™ (analýza světelných dat).

Hlavní výsledky a diskuse

• Vysoké rozlišení pro oddělení latexových standardů (25–150 nm) potvrzené online stanovením velikosti.
• Kompatibilita s virovými částicemi – FFF-MALS pro stanovení počtu a velikostní distribuce chřipkových virionů v souladu s TEM.
• Analýza tvarového faktoru (ρ=Rg/Rh) umožňuje rozlišit duté liposomy (ρ≈0,93) od plně zatížených (ρ<0,9) i tyčinkové částice (ρ>1,1).
• Konjugovaná analýza UV/Vis + RI + MALS kvantifikuje složení komplexních částic (lipidy vs. terapeutická molekula).
• Metoda pro stanovení účinnosti enkapsulace malých molekul pomocí detekce volné látky protečící přes membránu.
• Možnost provozní kontroly procesů – ultraDAWN™ poskytuje v reálném čase měření velikosti a molární hmotnosti až 30× za minutu.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimální příprava vzorku – separace sama eliminuje nečistoty a provádí dialýzu.
• Automatizovaný provoz ve spojení s HPLC modulárními komponentami.
• Měření velkých souborů částic pro vysokou statistickou spolehlivost.
• Kvantitativní a absolutní stanovení velikosti, tvaru, molární hmotnosti a koncentrace.
• Možnost frakcionace a sběru čistých podfrakcí pro offline testy.
• Podpora regulačních standardů (ISO TS 21362, ASTM WK 68060, NCI-NCL, EU-NCL).

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj integrovaných detekčních systémů s rozšířenou spektroskopií, elektrickou AF4 pro stanovení elektrokinetické mobility, zlepšení software pro automatickou optimalizaci metod a širší adopce v průmyslové výrobě osobně přizpůsobených nanoformulací. FFF-MALS-DLS se stane klíčovým nástrojem pro vývoj pokročilých lékových systémů s přesným řízením vlastností.

Závěr

Kombinace asymetrické průtokové frakcionace s MALS a DLS nabízí univerzální, vysoce rozlišenou a kvantitativní platformu pro charakterizaci nanočástic. Metoda splňuje požadavky regulačních autorit, poskytuje detailní profil velikosti, tvaru, molární hmotnosti a složení a umožňuje online monitoring procesů. Je připravena k dalšímu rozšíření a uplatnění v oblasti farmaceutického výzkumu a výroby.

Reference

1. Caputo F., Clogston J., Calzolai L., Rösslein M. & Prina-Mello A. Measuring particle size distribution of nanoparticle enabled medicinal products… Journal of Controlled Release 299, 31–43 (2019).
2. Hu Y., Crist R. M. & Clogston J. D. The utility of asymmetric flow field-flow fractionation for preclinical characterization of nanomedicines. Anal. Bioanal. Chem. (2019).
3. Gioria S. et al. Are existing standard methods suitable for the evaluation of nanomedicines: some case studies. Nanomedicine 13, 539–554 (2018).
4. Caputo F. et al. Measuring Particle Size Distribution by Asymmetric Flow Field Flow Fractionation: A Powerful Method for the Preclinical Characterization of Lipid-Based Nanoparticles. Mol. Pharm. 16, 756–767 (2019).
5. Clogston J. D. & Hu Y. NCL Method PCC-19: Asymmetric-Flow Field-Flow Fractionation. NCI-NCL (2016).
6. Mehn D., Caputo F. & Roesslein M. FFF-MALS method development… EUNCL-PCC-022 (2016).
7. Giddings J. C. A New Separation Concept Based on a Coupling of Concentration and Flow Nonuniformities. Sep. Sci. 1, 123–125 (1966).
8. Giddings J. Field-flow fractionation: analysis of macromolecular, colloidal, and particulate materials. Science 260, 1456–1465 (1993).
9. Wahlund K. G. & Giddings J. C. Properties of an Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation Channel Having One Permeable Wall. Anal. Chem. 59, 1332–1339 (1987).
10. Litzen A. & Wahlund K. G. Zone broadening and dilution in rectangular and trapezoidal asymmetrical flow field-flow fractionation channels. Anal. Chem. 63, 1001–1007 (1991).
11. Elsenberg S. & Johann C. Field-Flow Fractionation: Virtual Optimization for Versatile Separation Methods. LCGC The Column (2017).
12. Johann C., Elsenberg S., Schuch H. & Rösch U. Instrument and Method to Determine the Electrophoretic Mobility of Nanoparticles and Proteins by Combining Electrical and Flow Field-Flow Fractionation. Anal. Chem. 87, 4292–4298 (2015).
13. Wyatt P. J. Light scattering and the absolute characterization of macromolecules. Anal. Chim. Acta 272 (1993).
14. Van Holde K. E. Physical biochemistry. Prentice-Hall (1971).
15. Wei Z. et al. Biophysical characterization of influenza virus subpopulations using field flow fractionation and multiangle light scattering… J. Virol. Methods 144, 122–132 (2007).
16. Palmer A. F., Wingert P. & Nickels J. Atomic force microscopy and light scattering of small unilamellar actin-containing liposomes. Biophys. J. 85, 1233–1247 (2003).
17. Hsieh V. H. & Wyatt P. J. Measuring proteins with greater speed and resolution while reducing sample size. Sci. Rep. 7, 10030 (2017).
18. Patel B. A. et al. Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control. MAbs 10, 945–950 (2018).
19. Tanford C. Physical chemistry of macromolecules. John Wiley & Sons (1961).
20. Tinker D. O. Light scattering by phospholipid dispersions: Theory of light scattering by hollow spherical particles. Chem. Phys. Lipids 8, 230–257 (1972).
21. Ortega A. & Garcia De La Torre J. Hydrodynamic properties of rodlike and dislike particles in dilute solution. J. Chem. Phys. 119, 9914–9919 (2003).
22. Perrin F. Brownian movement of an ellipsoid. II. Free rotation and depolarization of fluorescence. J. Phys. Radium 7, 1–11.
23. Santos N. C. & Castanho M. A. R. B. Teaching light scattering spectroscopy: The dimension and shape of tobacco mosaic virus. Biophys. J. 71, 1641–1650 (1996).
24. Jahn A., Vreeland W. N., DeVoe D. L., Locascio L. E. & Gaitan M. Microfluidic directed formation of liposomes of controlled size. Langmuir 23, 6289–6293 (2007).
25. Wen J., Arakawa T. & Philo J. S. Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions. Anal. Biochem. 240, 155–166 (1996).
26. Hinna A., Steiniger F., Hupfeld S., Brandl M. & Kuntsche J. Asymmetrical flow field-flow fractionation with on-line detection for drug transfer studies: A feasibility study. Anal. Bioanal. Chem. 406, 7827–7839 (2014).
27. Citkowicz A. et al. Characterization of virus-like particle assembly for DNA delivery using asymmetrical flow field-flow fractionation and light scattering. Anal. Biochem. 376, 163–172 (2008).
28. Gräfe D., Gaitzsch J., Appelhans D. & Voit B. Cross-linked polymersomes as nanoreactors for controlled and stabilized single and cascade enzymatic reactions. Nanoscale 6, 10752–10761 (2014).
29. Boye S., Polikarpov N., Appelhans D. & Lederer A. An alternative route to dye-polymer complexation study using asymmetrical flow field-flow fractionation. J. Chromatogr. A 1217, 4841–4849 (2010).