Field-Flow Fractionation of Macromolecules and Structures That Cannot be Characterized by Conventional GPC/SEC Techniques

Význam tématu

Field-Flow Fractionation (FFF) představuje univerzální separační techniku, která umožňuje studium makromolekul, biopolymerů a nanočástic v širokém velikostním rozsahu bez potřeby stacionární fáze. Díky odlišnému principu separace (tok kapaliny v laminárním proudu a vnější pole působící kolmo ke směru průtoku) překonává omezení tradiční gelové permeační chromatografie (GPC/SEC) a rozšiřuje analytické možnosti v oblasti farmacie, biotechnologií i materiálových věd.

Cíle a přehled studie / článku

Článek prezentuje platformu Postnova FFF a demonstruje její využití prostřednictvím:

• Asymetrické Flow FFF (AF4) pro charakterizaci cyklického peptidu SL155 a lipoproteinů HDL.
• Centrifugální FFF (CF3) pro separaci polymerů a polyelektrolytů na nanostrukturách.
• Termální FFF (TF3) pro diferenciaci kopolymerů PS/PMMA podle chemického složení.

Použitá metodika a instrumentace

Pro jednotlivé experimenty byly použity tyto přístroje:

• Postnova AF2000 Multi Flow FFF systém (AF4), kanál NovaRC 10 kDa, 350 µm.
• Injector PN5300 Auto Injector.
• UV detektor PN3241 (254 nm) a refraktometr PN3150.
• MALS detektor PN3621 (532 nm).
• Smart Stream Splitter PN1650 pro zvýšení citlivosti.
• Centrifugální FFF CF3 (pole až 2500 g).
• Termální FFF TF3 (teplotní gradient až Δ120 °C).
• Analýza tvaru pomocí softwaru SASview pro SANS data.

Hlavní výsledky a diskuse

• AF4 analýza peptidu SL155 odhalila dominantní populaci unimerů (Mw ~5,4×10^4 g/mol) a minoritní agregáty (Mw ~2,3×10^6 g/mol, Rg ~65 nm), v souladu s výsledky SLS/SANS.
• Použití kombinovaného modelu Gaussian chain a rod-faktoru (L ~160 Å, R ~20 Å) poskytlo konzistentní popis morfologie v rovině SANS.
• Centrifugální CF3 umožnilo oddělit volný polyelektrolyt od křížově vázaných nanopartikulárních komplexů a stanovit distribuci velikostí (n-averáž ~30 nm, w-averáž ~41 nm).
• Termální TF3 prokázalo separaci PS a PMMA kopolymerů v THF podle chemického složení, což klasické SEC nezvládlo.
• Smart Stream Splitting navýšilo citlivost analýzy lipoproteinů HDL až pětinásobně pro následnou hmotovou spektrometrii.

Přínosy a praktické využití metody

• Široký separační rozsah od malých peptidů (~600 Da) po nanočástice (>100 nm).
• Eliminace interakcí se stacionární fází, redukce ko-eluce a nespecifických vazeb.
• Flexibilní nastavení separačního pole (průtok, gravitační, tepelný) pro optimální rozlišení.
• Kombinace s detektory MALS, UV, RI, SANS/SLS pro komplexní charakterizaci.
• Rychlé přepínání mezi metodami bez fyzické výměny kolony, úspora času a nákladů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace mikrofluidních FFF modulů pro vysokou propustnost a miniaturizaci.
• Rozšíření v biomedicínských aplikacích: exosomy, virové částice, nosiče léčiv.
• Automatizace a aplikace strojového učení pro analýzu multimodálních dat.
• Vývoj nových membrán a povlaků pro selektivitu a odolnost vůči agresivním médiím.
• Propojení FFF s hmotnostní spektrometrií a SANS/SAXS pro multidimenzionální charakterizaci.

Závěr

Field-Flow Fractionation poskytuje univerzální, přizpůsobitelnou a vysoce citlivou platformu pro charakterizaci makromolekul, polymerů a nanočástic. Kombinace AF4, CF3 a TF3 se špičkovými detekčními metodami rozšiřuje analytické možnosti tam, kde tradiční chromatografické techniky narážejí na limity stacionární fáze a velikosti vzorku.

Reference

Ghadiri M.R.; Granja J.R.; Milligan R.A.; McReynolds C.; Chadwick L.M., Nature, 1993, 366(6453), 324.
Horne W.S.; Price J.L.; Ke Z.; Miller S.M.; Gellman S.H., Bioorg. Med. Chem., 2005, 13(17), 5145.
Chapman R.; Laughton C.; Dean R.; Rigby J., Chem. Soc. Rev., 2012, 41, 6023.
Couet J.; Biesalski M.; Wolf H.; et al., Small, 2008, 4(7), 1008.