Minimizing photobleaching of Blue Fluorescent Protein (BFP) using the Agilent Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer

Význam tématu

Fotoblení je hlavní omezení při měření fluorescence citlivých fluoroforů, jako je modrý fluorescenční protein (BFP). Díky nízkému kvantovému výtěžku a rychlé ztrátě signálu během intenzivního nebo dlouhodobého ozáření bývá obtížné dosáhnout stabilních a spolehlivých výsledků, zejména v kinetických studiích a aplikacích typu FRET.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo porovnat rozsah fotoblení BFP při použití spektrofotometru Agilent Cary Eclipse se speciálním xenonovým flashlampou oproti standardnímu přístroji s kontinuálním xenonovým obloukovým lampou. Autoři sledovali úbytek emisního signálu v sériových skenech za kontrolovaných podmínek.

Použitá metodika

Vzorek: kvasinky S. cerevisiae exprimující BFP byly rozlýzovány a ředěny v 50 mM Tris/HCl pH 8.
Parametry měření:

• Excitace: 370 nm
• Emise: 400–550 nm
• Režim: cyklické skenování (cycle mode)
• Rychlost skenu: 120 nm/min
• Počet skenů: 10 za sebou

Použitá instrumentace

• Agilent Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer
• Peltier termostatovaná držadla s elektromagnetickým mícháním
• Regulátor a sondy teploty
• Magnetická míchadla
• Srovnávací spektrofotometr s kontinuálním xenonovým obloukem

Hlavní výsledky a diskuse

Měření na Cary Eclipse ukázalo pokles emise BFP o 2,4 % za 21,5 min (10 skenů), zatímco konvenční přístroj zaznamenal 19,1 % úbytku signálu za obdobnou dobu. Pulzní xenonová flashlampa (2 µs puls, 80 Hz) omezuje ozáření vzorku pouze na okamžiky snímání, čímž minimalizuje fotoblení a zároveň umožňuje vysoký poměr signál/šum.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné snížení fotoblení u citlivých fluoroforů
• Zachování kvality signálu během dlouhodobých měření
• Umožnění kinetických experimentů od milisekund po hodiny
• Prodloužená životnost lampy díky omezenému vystavení

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšířená aplikace pulzních zdrojů světla v biochemických a buněčných studiích, včetně:

• Real-time monitoringu in vivo
• Pokročilých FRET a time-resolved technik
• Super-resolution fluorescence mikroskopie
• Vývoje lamp s vyšší frekvencí a nižší energií pro další redukci fotoblení

Závěr

Xenonová flashlampa spektrofotometru Cary Eclipse významně snižuje fotoblení BFP díky pulsnímu režimu ozáření pouze během měření, čímž zajišťuje spolehlivé a kvalitní fluorescence dat a flexibilitu pro široké spektrum aplikací.

Reference

• Tsien RY. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 1998;67:509–44.
• Gavin P, Prescott M. Monitoring fluorescence resonance energy transfer (FRET) between GFP fusions in lysates of Saccharomyces cerevisiae using the Agilent Cary Eclipse. Fluorescence Application Note. 2001;#9.
• Agilent Technologies. Part numbers for Cary Eclipse and accessories. Publication 5990-7791EN; 2011.
• Prescott M, et al. Expression of BFP in S. cerevisiae. Biochemical and Biophysical Research Communications. 1994;207:943–949.