Anisotropy Measurement Using the Agilent Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer

Význam tématu

Fluorescenční anisotropie umožňuje bezkontaktní a nedestruktivní sledování molekulárních vlastností vzorků. Díky tomu poskytuje cenné informace o velikosti, tvaru a pohyblivosti molekul v různých prostředích. Metoda nachází uplatnění v materiálové vědě, biologii, molekulární biologii, imunologii i akademickém výzkumu, kde přináší robustní výsledky i u fotosenzitivních látek.

Cíle a přehled studie

Článek popisuje technický přehled měření fluorescenční anisotropie na přístroji Agilent Cary Eclipse. Hlavními cíli jsou:

• Prezentovat výhody nedestruktivní povahy techniky.
• Ukázat instrumentální konfiguraci a software využívaný ke sběru dat.
• Ilustrovat schopnost metody odlišit molekulární chování ve třech typech médií (PMMA, ethylenglykol, voda).

Použitá metodika a instrumentace

Měření se provádí polarizovaným excitačním světlem a detekcí intenzity emise v různých orientacích. Klíčové komponenty:

• Agilent Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer s výkonnou xenonovou výbojkou, která flashuje 80× za sekundu, čímž minimalizuje fotodegradaci.
• Polarizátory umístěné v excitační i emisní dráze.
• Software Agilent Cary WinFLR pro řízený sběr dat, výpočet anisotropie, vizualizaci spekter a průvodcovské nástroje během měření.

Hlavní výsledky a diskuse

Studie demonstruje:

• Rhodamin B v PMMA vykazuje vysokou anisotropii blízkou teoretickému maximu díky velmi omezené rotaci molekul.
• V ethylenglykolu a ve vodě anisotropie klesá, odráží rozdílnou viskozitu a volnost pohybu molekul.
• Teplotní experiment ukazuje, že intenzita fluorescence se mění složitě s teplotou, avšak anisotropie odráží čistě vázání molekul a strukturu média odděleně od změn intenzity.

Přínosy a praktické využití metody

Fluorescenční anisotropie nabízí:

• Odolnost vůči vlivům koncentrace a teplotních změn – měření nejsou zkreslena změnami intenzity.
• Nedestruktivní průběžné analýzy i fotosenzitivních vzorků díky flash režimu excitační lampy.
• Vysokou opakovatelnost a přesnost, vhodné pro kvantitativní hodnocení molekulárních interakcí, viskozity a dynamiky.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávaný rozvoj zahrnuje:

• Integraci anisotropie do mikrofluidních platforem pro vysoko-throughput analýzy.
• Pokročilou kombinaci s dalšími fluorescenčními technikami (FRET, FLIM) pro komplexní studium živých buněk.
• Automatizované workflow a strojové učení pro rychlejší zpracování dat a identifikaci nových biologických vzorců.

Závěr

Agilent Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer spolu se softwarem Cary WinFLR poskytuje spolehlivé měření fluorescenční anisotropie bez rizika fotodegradace. Metoda se osvědčila při charakterizaci molekul v různých médiích i při změnách teploty a nabízí široké možnosti aplikací v akademickém i průmyslovém prostředí.

Reference

• Gavin P., Prescott M., Fyfe D. J., Comerford J. J. Minimizing photobleaching of Blue Fluorescent Protein using the Agilent Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer. Agilent Technologies Application Note, 5990-7791EN (2011).
• Lakowicz J. R. Ch. 10: Fluorescence Anisotropy. In Principles of Fluorescence Spectroscopy. 3rd Edn. Springer, New York (2006).