Cytosolic expression of Green Fluorescent Protein (GFP) and its derivatives in the yeast Saccharomyces cerevisiae: Detection in vivo using the Agilent Cary Eclipse

Význam tématu

Detekce a charakterizace fluorescenčních proteinů v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae umožňuje sledovat buněčné procesy v reálném čase bez poškození vzorků. GFP a jeho barevné deriváty poskytují cenné markery pro studium genové exprese, lokalizace proteinů a interakcí v živých modelech, což otevírá nové možnosti pro biochemický výzkum a biotechnologické aplikace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo demonstrovat schopnost Agilent Cary Eclipse fluorescenčního spektrofotometru s multicell holderem a teplotní regulací měřit emisní spektra GFP a jeho derivátů (BFP, CFP, YFP, DsRed) přímo v cytosolu živých kvasinkových buněk. Autoři prezentují jednoduchý protokol pro přípravu vzorků a nastavení měření.

Použitá metodika

Kultivované kvasinky byly promyty vodou, suspendovány na OD650 0,55 a udržovány v teplotě 25 °C s magnetickým mícháním. Pro každý fluorescenční protein byla zvolena odpovídající excitace podle literárních dat a následně byl skenován emisní signál v rozsahu typickém pro daný fluorofor.

Použitá instrumentace

• Agilent Cary Eclipse fluorescenční spektrofotometr
• Peltier-thermostatted multicell holder s elektromagnetickým mícháním
• Teplotní řadič a teplotní sondy
• Magnetické míchací tyčinky
• Čtyři křemenné kyvety

Hlavní výsledky a diskuse

Všechny fluorescenční proteiny vykázaly emisní spektra v souladu s literárními hodnotami při minimálním pozadí autofluorescence a rozptylu, díky interním filtrům monochromátorů. Obzvláště u UV-excitovaných proteinů (BFP) je potlačení autofluorescence klíčové pro spolehlivou detekci. Metoda dovoluje kvalitativní i kvantitativní rozlišení spektrálně blízkých fluoroforů a předznamenává využití pro pokročilé studie FRET.

Přínosy a praktické využití metody

Popisovaný přístup nabízí rychlou, reprodukovatelnou a neinvazivní analýzu více fluorescenčních markerů v živých buňkách. Umožňuje simultánní sledování dynamiky proteinů, studium protein–proteinových interakcí a monitorování buněčných odpovědí na vnější podněty bez fixace či extrakce.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření do vysokokapacitních screeningů s vícekanálovými vzorkovišti, integrace s mikrotitrovacími deskami a mikrofluidními systémy pro dynamické studie. Další výzvou je kvantitativní FRET pro detailní mapování interakcí a modulace proteinových sítí v reálném čase.

Závěr

Agilent Cary Eclipse se sadou multicell a teplotní regulací představuje efektivní platformu pro in vivo měření a charakterizaci fluorescenčních proteinů v kvasinkách. Nabízí vysokou citlivost, nízký šum a možnost sledování více fluoroforů najednou, což podporuje široké spektrum biochemických a biologických aplikací.

Reference

• Chalfie M., et al. Science. 1994;263:802.
• Gerdes H-H., Kaether C. FEBS Lett. 1996;389:44-47.
• Clontech Web Site: seznam excitation/emission maxim.
• Matz M.V., et al. Nat Biotech. 1999;17:969-973.
• Prescott M., et al. Biochem Biophys Res Commun. 1994;207:943-949.
• Lakowicz J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. 2nd ed. 1999.
• Agilent Technologies. Application Note SI-A-1831. 2011.