Time-resolved Measurements Using the Agilent Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer

Význam tématu

Time-resolved fluorescence umožňuje oddělit krátkodobé pozadí od dlouhodobé emisní odezvy, čímž zvyšuje citlivost i selektivitu analytických metod. Díky časové analýze emisního signálu lze potlačit autofluorescenci vzorku a dosáhnout extrémně nízkých detekčních limitů v aplikacích biochemie a klinické diagnostiky.

Cíle a přehled studie / článku

Tento technický přehled prezentuje Agilent Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer s Xenonovou výbojkou a popisuje jeho schopnosti pro časově rozlišená měření. Článek demonstruje principy simultánního záznamu promptní (ns) a dlouhodobé (ms) emisní odezvy, optimalizaci parametrů delay a gate a ilustruje výkon na modelovém systému europia (Eu3+) v roztoku i v polymethylmethakrylátové (PMMA) matrici.

Použitá metodika a instrumentace

• Agilent Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer se Xenonovou flashlampou (80 Hz, peak výkon >75 kW, malý oblouk pro vysokou jasnost)
• Režimy měření fluorescence (promptní emise) a phosphorescence (zpožděná emise)
• Nastavení delay time (čas od pulsu lampy k zahájení detekce) a gate time (doba sběru emisního signálu)
• Software WinFLR pro analýzu kinetiky rozpadu a výpočet emisních životností

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizací delay time bylo možné eliminovat krátkodobou autofluorescenci (~450 nm) a zaměřit se výhradně na dlouhodobou emisi Eu3+ (~615 nm).
• Zvýšení gate time vedlo k vyšší intenzitě dlouhodobé emise, zatímco promptní složka zůstala konstantní.
• Simultánní záznam obou emisních režimů z jednoho vzorku bez výměny příslušenství potvrzuje vysoký uživatelský komfort přístroje.
• Kinetická měření Eu3+ v PMMA matrici s časovým rozlišením 40 µs prokázala vynikající poměr signál/šum a umožnila stanovit rychlostní konstantu k ≈2,84 ms⁻¹ a emisní životnost τ ≈0,35 ms.

Přínosy a praktické využití metody

Time-resolved fluorescence s lanthanoidním značením nachází široké uplatnění v:

• Imunoanalytických testech (TR-FRET, LRET)
• Receptorových a ligandových vazbových studiích
• Enzymových, cytotoxicitních a adherentních assay
• Analýze proteinových konformací a dynamiky
• Detekci stopových analytů (plyny, pesticidy, antibiotika)

Budoucí trendy a možnosti využití

• Multiplexní a vysokopropustné (HTS) aplikace
• Integrace do mikroskopických a imagingových systémů pro živé buňky
• Vývoj nových luminoforů s prodlouženou životností a specifickými vlastnostmi
• Implementace umělé inteligence pro automatizovanou analýzu časových dat
• Miniaturizace a přenosné aparatury pro terénní měření

Závěr

Agilent Cary Eclipse představuje robustní platformu pro časově rozlišená fluorescenční a fosforescenční měření s vynikajícím potlačením pozadí, vysokou citlivostí a reprodukovatelností bez fotodegradace vzorků. Umožňuje simultánní získání promptní i dlouhodobé emise, přesné stanovení kinetických konstant a emisních životností, čímž rozšiřuje analytické možnosti v biologické a environmentální chemii.

Reference

• Lakowicz JR. Chapter 3: Fluorescence Anisotropy. In Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed., Springer Science+Business Media; 2006.
• Diamandis EP. Clin Biochem. 1988;21:139–150.