The Linear Dynamic Range and Limits of Detection of Fluorescein using the Agilent Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer

Význam tématu

Fluorescein jako významný fluorescenční marker umožňuje citlivou analýzu biologických vzorků a současně minimalizuje rušivou autofluorescenci při UV excitaci.

Cíle a přehled studie

Cílem této technické zprávy je demonstrovat lineární dynamický rozsah spektrofotometru Agilent Cary Eclipse při měření fluoresceinu v 0,01 M NaOH a stanovit jeho limit detekce pod definovanými podmínkami.

Použitá instrumentace

• Agilent Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer
• Křemenná kyveta s optickou dráhou 10 mm
• Standardní roztok AR Grade fluoresceinu v 0,01 M NaOH (koncentrace 0,1 pM až 1 060 nM)

Použitá metodika

Měření probíhalo při excitaci 480 nm a emisi 520 nm se štěrbinami 10 nm a signálovým průměrováním 1 s. Intenzita fluorescence byla odečítána s korekcí blanku; v případě saturace detektoru PMT se upravovalo napětí. Lineární dynamický rozsah byl stanoven z log-log kalibrace intenzity vůči teoretické koncentraci, LOD pak jako trojnásobek směrodatné odchylky blank signálu.

Hlavní výsledky a diskuse

Instrument prokázal lineární odezvu (r2 = 0,99993) napříč pěti řády koncentrací (10 pM až 1,06 µM). Průměrný limit detekce vypočtený ze pěti přístrojů činil 0,48 pM (metoda 3× SD blanku) a alternativně 0,45 pM z regresní analýzy, což potvrzuje vysokou citlivost a opakovatelnost měření.

Přínosy a praktické využití metody

• Detekce stopových koncentrací fluoresceinu s vysokou přesností
• Široký lineární rozsah umožňuje kvantifikaci v rozsahu několika řádů velikosti
• Vhodné pro QA/QC procesy, bioanalytické aplikace a vývoj farmaceutických metod

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda se dá rozšířit na další fluorescenční sondy a multiplexní analýzy. Integrace mikropotekových systémů, pokročilých detektorů a AI-podporované zpracování dat může zvýšit automatizaci, propustnost a analytickou přesnost.

Závěr

Agilent Cary Eclipse prokázal vynikající lineární rozsah a extrémní citlivost pro fluorescein v 0,01 M NaOH s LOD přibližně 0,5 pM, což jej činí ideálním pro vysoce náročné bioanalytické aplikace.

Reference

• ASTM E578-07: Standard Test Method for Linearity of Fluorescence Measuring Systems
• ASTM E579-04: Standard Test Method for Limit of Detection of Fluorescence of Quinine Sulphate