UPLC Method Development and Validation

Význam tématu

Ultrarychlá kapalná chromatografie (UPLC) představuje moderní nástroj analytické chemie, který využívá sub-2 µm částice pro dosažení vyššího rozlišení, rychlosti a citlivosti než konvenční HPLC. Urychlení vývoje metod a zkrácení doby analýzy přináší významnou výhodu při vývoji léčiv, kvalitativní a kvantitativní kontrole v průmyslu a výzkumných laboratořích.

Cíle a přehled článku

Cílem dokumentu je představit systematický přístup k návrhu, optimalizaci a validaci analytických metod na UPLC platformě. Autoři demonstrují protokol selektivního screeningu, výběru vhodného pH, organického rozpouštědla a chromatografické fáze, dále pak strategie doladění gradientu, teploty a automatizace procesu včetně softwarové validace.

Použitá metodika a instrumentace

Metodologie zahrnuje čtyřkombinační scoutingovou matici: dvě mobilní fáze (acetonitril, methanol), dvě pH (3 a 10) a čtyři typy UPLC kolon (BEH C18, BEH Shield RP18, BEH Phenyl, HSS T3). Analýzy probíhají za gradientního módu (5 %→90 % B) při průtoku 0,5 mL/min a teplotě až 60 °C. Validace metod je realizována pomocí softwaru Empower 2 Method Validation Manager.

Hlavní výsledky a diskuse

Screening ukázal, že pH a organické rozpouštědlo výrazně ovlivňují retenci ionizovatelných látek, přičemž analyty v neionizované formě vykazují vyšší retenční faktory. Methanol jako slabší eluční fáze prodlužuje retenci a zvětšuje rozdíly selektivity mezi kolonami. Největší posun v separaci byl dosažen kombinací pH 10 a acetonitrilu při použití BEH C18 kolony. Optimalizace gradientu a zvýšení teploty na 60 °C vedly k finální metodě pro paroxetin a související sloučeniny s uspokojivým rozlišením (USP Rs > 1,9) a dobrou špičkovou symetrií.

Přínosy a praktické využití metody

Navržená UPLC metoda umožňuje vyvinout a validovat analytickou metodu během jednoho pracovního dne, což představuje trojnásobné zrychlení oproti HPLC s 3,5 µm částicemi. Přesná validace potvrdila linearitu (R²=0,9999), opakovatelnost, mez. detekce nečistot a robustnost v požadovaných mezích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším rozvojem je integrace plně automatizovaných scoutingových stanic s inteligentními algoritmy pro návrh metod, rozšíření UPLC na vysokotlakou přípravu vzorků (SFC coupling) a kombinace s vysokorozlišovacími hmotnostními spektrometry pro komplexní analýzu biologicky aktivních molekul.

Závěr

Systematický přístup k vývoji metod na UPLC s využitím screeningu pH, rozpouštědla a stacionární fáze spolu s optimalizací gradientu a teploty přináší rychlou a spolehlivou platformu pro analytickou chemii. Automatizace a softwarová podpora validace dále zkracují čas potřebný k uvedení metod do provozu a zajišťují plnění regulatorních požadavků.

Reference

1. Waters Corporation. UPLC Method Development and Validation, Rev. 2, 2008.
2. Neue, U. D. American Laboratory, 1999, 22, 36–39.