Improving Label-Free Quantification of Plasma and Serum Proteins Using a High-Resolution Hybrid Orbitrap Mass Spectrometer

Význam tématu

Label-free hmotnostní spektrometrie umožňuje analyzovat bílkoviny v plazmě a séru bez potřeby značení, což výrazně urychluje workflow pro objevování biomarkerů, snižuje náklady a minimalizuje složitost přípravy vzorků.

Cíle a přehled studie

Tato studie porovnává tradiční MS1 extrakci iontových chromatogramů se špičkovou inteligentní real-time MS2 akvizicí na vysokorozlišovacím orbitrapu. Cílem je zvýšit citlivost, selektivitu a důvěryhodnost kvantifikace proteinů v komplexní matrici lidské plazmy.

Použitá metodika

Vzorky obsahovaly osm standardních netypických proteinů v ekvimolárním poměru připravených ve „čistém“ roztoku i v lidské plazmě (1 µg na kolonu), přičemž koncentrace každého proteinu se pohybovaly v rozsahu 0,5–500 fmol. Všechny vzorky byly redukovány, alkylovány, digesto­vány trypsinem a analyzovány v triplikátech.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Q Exactive™ s Nanospray Flex™ iontovým zdrojem pro HR/AM analýzu.
• Softwary Thermo Scientific Proteome Discoverer™ a Pinpoint™ verze 1.3 pro identifikaci, tvorbu spektrální knihovny a kvantitativní zpracování dat v reálném čase.

Hlavní výsledky a diskuse

Ze vstupních dat bylo sestaveno spektrální databáze 170 cílených peptidů, využitá pro stavově řízenou real-time MS2 akvizici. Srovnání s klasickou MS1 XIC kvantifikací odhalilo:

• Pro koncentrace nad 2 fmol na kolonu dosahuje počet peptidů s vysokou důvěryhodností u MS1 i MS2 podobných hodnot.
• Pod 2 fmol klesá citlivost MS1 na polovinu ve srovnání s MS2 a pod 1 fmol se falešné pozitivy u MS1 pohybují mezi 25–50 %.
• Real-time MS2 akvizice vykazuje významně nižší míru izobarických interferencí a spolehlivější kvantifikaci při nízkých signálech (<1 × 10^4).

Přínosy a praktické využití metody

Real-time řízená MS2 akvizice přináší:

• Automatizované sestavování cílených kvantifikačních metod přímo ze spektrální knihovny.
• Možnost adaptivního nastavení akvizičních parametrů během běhu analýzy pro optimalizaci výkonu.
• Vyšší přesnost a selektivitu kvantifikace nízkoobsažných proteinů v komplexním biologickém pozadí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření inteligentních stavově řízených akvizičních režimů do vysoce paralelních experimentů, lepší integrace s algoritmy strojového učení pro pokročilou analýzu dat a nasazení v klinické proteomice pro rychlou a spolehlivou diagnostiku.

Závěr

Zavedení real-time stavově modelované MS2 akvizice na orbitrapu významně zvyšuje citlivost, selektivitu a důvěryhodnost label-free kvantifikace proteinů v plazmě a séru, zejména v oblasti nízkých fmol koncentrací.

Reference

• Prakash A., Peterman S., Frewen B. et al. Improving throughput for highly multiplexed targeted quantification methods using novel API-remote instrument control and state-model data acquisition schemes. 61st ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Minneapolis, MN, USA, June 9–13, 2013. Poster TP08 – Peptides: Quantitative Analysis I, poster number 131.