Global Plasma Proteome Quantification Using Internal Standard Triggered Targeted Analyses

Význam tématu

Plazmatický proteom zahrnuje stovky proteinů, které představují potenciální biomarkery pro diagnostiku, prognózu a monitorování onemocnění. Přesná a reprodukovatelná kvantifikace těchto proteinů je nezbytná pro validaci kandidátních biomarkerů a podporu personalizované medicíny. Tradiční rozsáhlé neřízené přístupy (DDA, DIA) často postrádají dostatečnou citlivost a robustnost pro analýzu velkých kohort. Vývoj cílených metod, jako je SureQuant, přináší vysokou citlivost a přesnost napříč širokým dynamickým rozsahem plazmatických proteinů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo představit a charakterizovat novou globální kvantifikační metodiku plazmatického proteomu založenou na interně standardem řízené cílené akvizici (IS-PRM) nazvané SureQuant. Metoda byla implementována v nativním ovládacím softwaru nejnovějších Orbitrap masových spektrometrů (Exploris 480, Eclipse Tribrid) a testována na analýze 1 µg neupravené lidské plazmy doplněné o 804 stabilně značených peptidů (PQ500 kit, Biognosys). Studie demonstrovala vysokou pokryvnost (~400 proteinů), citlivost od 4 amol do 15 pmol a opakovatelnost (75 % peptidů s CV < 10 %).

Použitá metodika a instrumentace

SureQuant využívá dvoustupňovou akvizici: režim „watch“ k detekci interních standardů na úrovni MS1 a rychlé nízkorizikové MS2, následuje režim „quant“ s vysokým rozlišením a delší dobou akvizice pro cílenou kvantifikaci endogenních peptidů. Metoda se konfiguruje pomocí přednastavených šablon z Skyline.

• Orbitrap Exploris 480
• Orbitrap Eclipse Tribrid
• Q Exactive HF-X (API varianta Single Scan Msx IS-PRM)
• UltiMate 3000 RSLC
• EASY-nLC 1200
• Evosep One (21min gradient)
• PQ500 SIL peptide kit (Biognosys)

Hlavní výsledky a diskuse

• Kvantifikováno ~560 endogenních peptidů reprezentujících 400 proteinů s dynamickým rozsahem od 4 amol do 15 pmol (6 řádů velikosti).
• Detekce 802 z 804 interních standardů při 70min gradientu, 721 při vyšší propustnosti (21min) variantou IS-PRM.
• Vysoká kvantifikační přesnost: 75 % peptidů s CV < 10 %, medián CV 6 %.
• Vysoká opakovatelnost mezi operátory a chromatografickými systémy (R2 ~0,97).
• Užitečnost varianty Single Scan Msx IS-PRM pro pětinásobné zvýšení propustnosti za malého poklesu citlivosti.

Přínosy a praktické využití metody

SureQuant kombinuje výhody profilovacích a cílených přístupů: široké pokrytí plazmatického proteomu, vysoká citlivost, vynikající kvantifikační přesnost a robustnost. Přednastavené metody (PQ500 kit) umožňují uživatelům rychlý „load and play“ režim, což zkracuje dobu vývoje assay a zajišťuje konzistentní výsledky napříč laboratořemi. Vhodné pro výzkum biomarkerů, farmaceutické QA/QC a vysokopropustné klinické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj metodiky bude směřovat k dalšímu zvyšování propustnosti a integraci API-řízených akvizičních variant do nativního softwaru Orbitrap přístrojů. Očekává se rozšiřování panelů interních standardů, včetně modulárních kitů pro specifické indikace. Kombinace s pokročilou bioinformatikou a strojovým učením umožní efektivnější analýzu komplexních dat a identifikaci nových biomarkerů.

Závěr

Metoda SureQuant představuje významný pokrok v globální kvantifikaci plazmatického proteomu, spojující vysokou citlivost, dynamický rozsah a robustnost cílené akvizice s pokrytím profilovacích experimentů. Přednastavené šablony a rozsáhlé spektrum interních standardů zajišťují konzistentní výsledky napříč systémy a laboratořemi, což podporuje validaci biomarkerů a translaci do klinické praxe.

Reference

• Gallien S, Wang J, Gajadhar AS, Patel B, Kellmann M, Arrey TN, Harder A, Huguet R, McAlister G, Bailey D, Eliuk S, Xuan Y, Huhmer A, Chen EL. Global Plasma Proteome Quantification Using Internal Standard Triggered Targeted Analyses. Thermo Fisher Scientific White Paper; 2019.