Improvements in LFQ for reproducible quantification of proteomic experiments: how DDA outperforms DIA

Význam tématu

Proteomická kvantifikace bez štítků (LFQ) je klíčovou metodou pro analýzu komplexních biologických vzorků. Porovnání datově závislého (DDA) a nezávislého pořizování (DIA) umožňuje vyhodnotit citlivost, hloubku pokrytí a reprodukovatelnost výsledků v proteomice.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo srovnat vysokočinné kvadrupól-Orbitrapové metody DDA a DIA pro label-free kvantifikaci proteomů. Analýza se zaměřila na počet identifikací peptidů a proteinů, reprodukovatelnost mezi experimenty a vliv délky chromatografické kolony (50 a 75 cm).

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorek: HeLa proteinový digest s HRM peptide standardy
• Chromatografie: Thermo Scientific EASY-nLC 1200 se sloupci Acclaim PepMap 50 cm a 75 cm
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific Q Exactive HF MS
• Software pro DDA: Proteome Discoverer 2.2 s algoritmem Minora a SEQUEST HT
• Software pro DIA: Spectronaut 9.0

Hlavní výsledky a diskuse

• DDA dosahuje vyššího počtu spektrálních shod (PSM), identifikovaných peptidů a proteinů než DIA.
• Použití 75 cm kolony zvýšilo počet identifikací o 20–25 % oproti 50 cm variantě.
• DDA prokázala lepší meziexperimentální reprodukovatelnost s více kvantifikovatelnými peptidy při CV nižší než 20 %.
• Vysoká korelace intenzit mezi replikáty (r ≈ 0,96) potvrzuje stabilitu metody DDA LFQ.
• DIA vyžaduje knihovnu spekter, což zpomaluje pracovní postup a snižuje efektivitu oproti DDA LFQ integrované v Proteome Discoverer.

Přínosy a praktické využití metody

• Provoz v režimu DDA LFQ zjednodušuje pracovní postup, eliminuje nutnost předchozího vytváření spektrálních knihoven.
• Integrace s Proteome Discoverer usnadňuje škálování, normalizaci a správu studií.
• Metoda je vhodná pro QA/QC procesy v průmyslové analýze i výzkumné laboratoři.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zlepšení hloubky proteomové analýzy pomocí optimalizovaných gradientů a sloupců.
• Integrace strojového učení pro lepší zpracování a interpretaci velkých datových souborů.
• Vývoj nových algoritmů pro automatizovanou identifikaci a kvantifikaci peptidů v DDA režimu.
• Rozšíření aplikací do klinické proteomiky a personalizované medicíny.

Závěr

Výsledek studie potvrzuje převahu DDA LFQ workflow integrovaného v Proteome Discoverer nad DIA přístupy z hlediska citlivosti, reprodukovatelnosti a efektivity. Použití delších kolon výrazně zvyšuje hloubku pokrytí proteomu bez nutnosti tvorby spektrálních knihoven.