IMSC: Improvements in LFQ for reproducible quantification of proteomic experiments: how DDA outperform DIA

Význam tématu

Label-free kvantitativní proteomika umožňuje citlivou analýzu a porovnávání proteinových vzorků bez potřeby chemických značení. Data-dependent acquisition (DDA) a data-independent acquisition (DIA) na vysokorozlišovacích orbitrapových spektrometrech patří mezi nejpoužívanější přístupy. Porovnání těchto metod z hlediska počtu identifikovaných peptidů a reprodukovatelnosti kvantifikace je zásadní pro optimalizaci proteomických workflow v biologickém a farmaceutickém výzkumu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo porovnat výkonnost HRAM quadrupole-Orbitrap DDA a DIA metod při analýze HELA proteinového digestu ve standardizovaném workflow. Hlavními metrikami hodnocení byly citlivost detekce, celkový počet identifikovaných a kvantifikovaných peptidů a proteinů, reprodukovatelnost mezi replikáty a vliv délky analytické kolony.

Použitá metodika a instrumentace

All solvents were LC-MS grade (Fisher Scientific). Solvent A: 100 % voda, 0.1 % kyselina mravenčí. Solvent B: 80 % acetonitril, 20 % voda, 0.1 % kyselina mravenčí. Vzorky: 500 ng/µL HELA digest (Pierce) doplněný HRM peptidovými standardy (Biognosys).
Chromatografie:

• Thermo Scientific EASY-nLC 1200
• Acclaim PepMap kolony 75 µm ID, délka 50 cm (ES803) a 75 cm (ES805), částice 2 µm, teplota 55 °C
• Gradient 5–44 % B během 120 min při 300 nL/min

MS detekce:

• Thermo Scientific Q Exactive HF MS
• Režimy DDA a DIA

Software a zpracování dat:

• Proteome Discoverer 2.2.0.96 (SEQUEST HT, Percolator, Minora, Rt-Aligner, Feature Mapper)
• Spectral library pro DIA: výstup z DDA zpracovaný v Proteome Discoverer
• Spectronaut 9.0 pro MS1 kvantifikaci v DIA

Hlavní výsledky a diskuse

DDA v kombinaci s novým LFQ workflow prokázalo vyšší počet identifikací i kvantifikovatelných peptidů oproti DIA:

• 75 cm kolona: ~40 230 peptidů, 5 070 proteinů (DDA) versus 24 426 kvantifikovatelných peptidů (DIA)
• 50 cm kolona: ~32 013 peptidů, 4 828 proteinů (DDA) versus 16 968 kvantifikovatelných peptidů (DIA)
• Průměrná korelace mezi replikáty ~0,96 pro DDA i DIA
• Nižší variabilita kvantifikace (CV < 20 %) u DDA
• Delší kolony (75 cm) zvyšují hloubku proteomu v obou režimech

Vizualizace výsledků ukázala přehled chromatogramů, korelační boxploty, Vennovy diagramy překryvů a rozdělení intenzit.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace LFQ workflow v Proteome Discoverer umožňuje:

• Automatizované škálování, normalizaci a sledování studií
• Vyšší citlivost a hloubku proteomických analýz bez nutnosti předběžné přípravy spektrální knihovny
• Zjednodušenou integraci do rutinních QA/QC procesů

Budoucí trendy a možnosti využití

Budoucí vývoj se zaměří na:

• Další zkracování chromatografických běhů při zachování hloubky pokrytí
• Využití strojového učení pro zlepšení identifikace a kvantifikace
• Komplexní integraci s klinickými daty pro personalizovanou medicínu
• Rozšíření workflow na další třídy biomarkerů (např. post-translační modifikace)

Závěr

Studie ukazuje, že DDA na orbitrapových MS s pokročilým untargeted LFQ workflow nabízí vyšší počet identifikací, lepší reprodukovatelnost a větší efektivitu než DIA. Delší chromatografické kolony dále zvyšují proteomový protekční výkon bez kompromisů v kvalitě dat.

Reference

Nejsou uvedeny