Optimizing Analysis and Purification of a Synthetic Peptide Using PLRP-S Columns

Význam tématu

Syntetické peptidy nacházejí široké využití v biotechnologiích a farmacii. Jejich čistota a identifikace jsou klíčové pro účinnost a bezpečnost léčiv. Reversed-phase ion-pair chromatografie s trifluoroctovou kyselinou (TFA) se osvědčila pro analytickou i preparativní purifikaci, avšak přímý přechod z analytického formátu na preparativní vyžaduje sjednocení podmínek, chemie a fyzikálních parametrů kolony.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo optimalizovat analýzu a purifikaci syntetického peptidu GLP-1 (7-36) amide (molekulová hmotnost 3 297,7 Da) na analytické a následně preparativní úrovni. Studie prověřila dvě pórové velikosti (100 a 300 Å) a umožnila přímou škálovatelnost gradientních metod z analytické kolony 4,6 × 250 mm na preparativní formát 21,2 × 250 mm bez změny gradientu.

Použitá metodika

Syntéza GLP-1 proběhla sol-gelovou metodou na polystyren-divinylbenzenu s ochranou Fmoc skupin. Hrubé produkty ze dvou typů pryskyřic (AmphiSpheres 40 RAM 0,4 mmol/g a PL-Rink 0,3 mmol/g) byly na analytických PLRP-S kolonách 100 a 300 Å vyžádány pod gradientem 35–50 % organické fáze (0,1 % TFA v acetonitrilu) při 1 ml/min a teplotě 25 °C. Pro preparativní purifikaci byly aplikovány shodné gradienty při průtoku 21,2 ml/min a frakcionace v 2,5 ml frakcích po injekci 1 mg hrubého peptidu.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II analytický LC systém (G7120A, G7167B, G7116B, G7117C) s PLRP-S 4,6 × 250 mm kolónami 100 a 300 Å
• Agilent 1290 Infinity II preparativní LC systém (G7161B, G7157A, G7163B, G7165A) s PLRP-S 21,2 × 250 mm kolónami 100 a 300 Å
• Agilent 1290 Infinity II LC coupling k 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF (G6549AA) a AdvanceBio Peptide Mapping kolona 2,1 × 100 mm, 2,7 μm
• Software: Agilent OpenLab ChemStation CDS, MassHunter Data Workstation, BioConfirm

Hlavní výsledky a diskuse

Hrubé peptidy připravené na PL-Rink resině dosáhly vyšší výchozí čistoty (43 % vs 33 % na 100 Å kolóně). Optimalizovaný gradient 35–50 % B poskytl nejostrý tvar píku. Na preparativní úrovni byla čistota hlavní frakce až 97,8 % (PLRP-S 100 Å) a 90,6 % (300 Å) s výtěžností 92,7 % a 90,9 %. LC/MS potvrdila přítomnost iontových forem [M+2H]2+ až [M+5H]5+ odpovídajících očekávané hmotnosti peptidu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje přímé škálování bez nutnosti nového vývoje gradientu, šetří čas i zdroje. PLRP-S médium zajišťuje chemickou a mechanickou stabilitu, nevyžaduje dodatečné alkylové řetězce a poskytuje vysokou reproducibilitu. Pórová velikost 100 Å optimalizuje kapacitu, 300 Å zlepšuje transport větších molekul a ostrost separace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vyšší automatizace preparativních systémů, kontinuální chromatografie, nové chemické modifikace stacionárních fází, integrace s vysokorychlostními MS a udržitelné („green“) rozpouštědla otevírají prostor pro další optimalizaci a zvýšení propustnosti.

Závěr

Agilent PLRP-S kolony představují univerzální a robustní platformu pro analytickou i preparativní purifikaci syntetických peptidů. Přímé škálování gradientů z analytické na preparativní úroveň minimalizuje vývojové cykly a poskytuje vysokou čistotu i výtěžek. Metoda LC/MS s formičnou kyselinou efektivně potvrzuje identitu peptidu.