Determination of Myo-Inositol (Free and Bound as Phosphatidylinositol) in Infant Formula and Adult Nutritionals

Význam tématu

Myoinositol je zásadní cukr v lidském organismu, přítomný volně i vázaný v membránových fosfoinositidech. Zajišťuje regulaci buněčné osmolality, signální dráhy, vývoj nervového systému a tvorbu plicního surfaktantu u novorozenců. Vzhledem k nízkému obsahu myoinositolu v umělých mléčných formulích je jeho přesná a spolehlivá kvantifikace klíčová pro dodržení nutričních norem a prevenci deficitu u kojenců i dospělých.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je ověřit a popsat metodu vysokovýkonné aniontové výměnné chromatografie s pulzní amperometrií (HPAE-PAD) a technikou prohazování kolon (column switching) pro stanovení volného myoinositolu a myoinositolu vázaného jako fosfatidylinositol v suchých infantních formulích a tekutých výživových přípravcích pro dospělé.

Použitá instrumentace

• Ion chromatografický systém Thermo Scientific Dionex ICS-5000+ HPIC s duálním čerpadlem, eluentním generátorem EGC 500 KOH, detektorem pulzní amperometrie ED a autosamplerem AS-AP
• Kolony Dionex CarboPac PA1 (4×50 mm) pro předčištění a CarboPac MA1 (4×250 mm) pro separaci myoinositolu
• Kartuše Dionex OnGuard II RP pro odbourání matrice po hydrolýze
• Silikagelová SPE cartridge HyperSep 500 mg pro izolaci fosfatidylinositolu
• Mikrovlnné a kyselé hydrolýzy, biologické pufry a standardy myoinositolu a fosfatidylinositolu

Použitá metodika

1. Příprava vzorku volného myoinositolu
• Pro práškové formulě: odvážení 2,5 g vzorku, rozpuštění ve vodě, úprava pH na 4,5 a filtrace přes OnGuard II RP cartridge
• Pro tekuté výživy: 1 mL produktu ředěno vodou, obdobné čištění cartridge

2. Příprava vzorku vázaného myoinositolu jako fosfatidylinositol
Metoda 1 (SPE) podle AOAC 2011.18:
• Extrakce vzorku chloroform‐methanol, navození dvoufázového dělení, izolace fosfatidylinositolu na silikagelové SPE cartridgi, eluční postup směsí nepolárních a polárních rozpouštědel
• Sušení, kyselá hydrolýza (110 °C, 2 h) a neutralizace NaOH
• Čištění filtrací a OnGuard II RP cartridge před chromatografií
Metoda 2 (RP cartridge):
• Stejná extrakce jako u SPE, následuje kyselá hydrolýza bez SPE
• Očištění hydrolyzátu přímo na OnGuard II RP cartridge pro odstranění lipidů

3. Chromatografie a detekce
• Na PA1 guard kolonu 15 mM KOH k oddělení myoinositolu od pozdně eluujících sacharidů
• Po 1,5 min provedení přepnutí kolon na MA1 analytickou kolonu, eluční pufr 750 mM KOH, tok 0,4 mL/min, teplota 30 °C, injekce 20 µL
• Pulsní amperometrické měření s jednorázovou zlatou PTFE pracovní elektrodou bez potřeby leštění

Hlavní výsledky a diskuse

• Kalibrace 0,02–4 mg/L myoinositolu, lineární závislost s r2>0,999, LOD 1,6 µg/L, LOQ 5,4 µg/L
• Volný myoinositol ve standardním materiálu NIST SRM 1849 odpovídal certifikované hodnotě (40,3 mg/100 g), v mléčných formulích ~35,8 a 34,7 mg/100 g (119 % a 116 % deklarované hodnoty), v dospělém produktu ~0,34 mg/100 g
• Vázaný myoinositol představuje 0,8–2,6 mg/100 g v závislosti na typu vzorku; poměr vázaného vůči volnému je u dospělých přípravků až 8× vyšší
• Metoda 1 vykázala nižší výtěžnost (63–81 %) vázaného myoinositolu oproti metodě 2 (80–106 %), což souvisí s únikem fosfatidylinositolu při SPE
• Přesnost intradenních analýz RSD 0,7–3,8 %, mezidení RSD 0,3–6,2 %

Přínosy a praktické využití metody

• Nepotřebuje derivační úpravy jako GC nebo běžné HPLC s optickou detekcí
• Odstranění matricových interferencí technikou prohazování kolon zkracuje dobu analýzy
• Jednorázová Au/PTFE elektroda významně snižuje údržbu detektoru
• Metoda 2 s RP cartridge zrychluje přípravu a minimalizuje ztráty analytu

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace extrakčních a čiřicích kroků pro vyšší propustnost laboratoří
• Vývoj odolnějších elektrod s delší životností a nižším šumem
• Rozšíření metody na stanovení dalších polyolů a inositolizomerů v potravinářských matricích
• Využití mikrovlnné asistované hydrolýzy pro rychlejší uvolnění vázaného myoinositolu

Závěr

Ověřený HPAE-PAD postup s prohazováním kolon účinně stanovuje volný i vázaný myoinositol v kojeneckých a výživových formulích. Metoda nabízí vysokou citlivost, reprodukovatelnost a minimální nutnost údržby. Úprava vzorku pomocí RP cartridge zefektivnila stanovení vázaného myoinositolu a překonala ztráty spojené se silikagelovým SPE.

Reference

1. AOAC Official Method 2011.18 Myo-Inositol (Free and Bound as Phosphatidylinositol) in Infant Formula and Adult Nutritionals, Liquid Chromatography/Pulsed Amperometry with Column Switching; AOAC Official Methods of Analysis: 2012.
2. AOAC Official Method 2012.12 Free and Total Myo-Inositol in Infant Formula and Adult/Pediatric Nutritional Formula, High-Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection; AOAC Official Methods of Analysis: 2012.
3. Schimpf K., Thompson L. J. AOAC Int. 95, 937–942 (2012).
4. Ellingson D. et al. J. AOAC Int. 95, 1469–1478 (2012).
5. Tagliaferri E.G. et al. J. Chromatogr. A 879, 129–135 (2000).
6. Perelló J. et al. J. Chromatogr. B 802, 367–370 (2004).
7. Flores M.I.A. et al. Food Chem. 129, 1281–1286 (2011).
8. Brown L.D. et al. J. Nutr. 139, 1648–1652 (2009).
9. Hallman M. et al. Early Hum. Dev. 10, 245–254 (1985).
10. Majerus P.W. et al. Cell 63, 459–465 (1990).