Ultra-High-Resolution Separation of Oligonucleotides on Pellicular Anion-Exchange UHPLC Columns

Význam tématu

Oligonukleotidy představují klíčové nástroje v diagnostice a terapii geneticky podmíněných onemocnění. Přesná separace a charakterizace těchto molekul je nezbytná pro ověření jejich čistoty, identifikaci modifikací a splnění regulatorních požadavků.

Cíle a přehled studie / článku

Studie popisuje využití pelliculárních aniont-výměnných UHPLC kolon Thermo Scientific DNAPac PA200 RS pro ultra-vysokorozlišovací separaci terapeutických a diagnostických oligonukleotidů včetně modifikovaných forem.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda kombinuje aniont-výměnnou chromatografii s konkávními elucemi chloridových gradientů při pH řízeném 40 mM Tris (pH 8) nebo AMP (pH 9,5). Použity byly kolony DNAPac PA200 RS (4 µm, 4,6×150 mm a 4,6×250 mm). Systém Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLC zahrnoval duální gradientní čerpadlo DGP-3600RS, tepelný modul TCC-3000RS, autosampler WPS-3000TBRS a diodový detektor DAD3000RS při 260 nm. Data zpracováno v Chromeleon 6.8.

Hlavní výsledky a diskuse

• Homopolymery dT12–dT60: během 8,4 minuty bylo rozlišeno 49 plné délky dT oligonukleotidů a 26 vedlejších produktů syntézy pomocí konkávního 41–65 % NaCl gradientu.
• siRNA s 2’,5’-linkážemi: pět sekvencí s jednotlivou 2’,5’-modifikací na pozicích 1, 5, 10, 15 a 20 bylo účinně odděleno od standardní 3’,5’-linkáže, přičemž rozlišení vychází z konformačních změn.
• Fosforotioátové diastereomery: oligonukleotid se dvěma PS vazbami byl analyzován na 8 µm a 4 µm kolonkách. Pelliculární 4 µm fáze dosáhla o 28–42 % vyššího rozlišení dvojic Rp a Sp diastereomerů ve srovnatelném čase.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje vysokou citlivost a rychlost separace, usnadňuje detekci syntetických chyb, neúplných deprotektorů a izomerů, a je ideální pro kontrolu kvality v průmyslové i výzkumné praxi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj směřuje k integraci s LC–MS a HRAM-MS pro komplexní identifikaci modifikací, optimalizaci gradientů pro extrémně dlouhé sekvence a vývoji nových stacionárních fází pro zvýšenou selektivitu vůči pokročilým chemickým modifikacím.

Závěr

Pelliculární aniont-výměnné kolony DNAPac PA200 RS disponují vynikajícím rozlišením a rychlostí separace oligonukleotidů, včetně modifikovaných forem, což potvrzuje jejich vhodnost pro pokročilou QC a výzkum terapeutických oligonukleotidů.

Reference

1. Crooke S.T. Therapeutic applications of oligonucleotides. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1992;32:329.
2. Thiel K.W.; Giangrande P.H. Oligonucleotides. 2009;19(3):209.
3. Kurreck J. Angew. Chem. Int. Ed. 2009;48:1378.
4. van Ommen G.J.; van Deutekom J.; Aartsma-Rus A. Curr. Opin. Mol. Ther. 2008;10(2):140.
5. Lenert P.S. Mediators Inflamm. 2010;2012:1.
6. Kole R.; Krainer A.R.; Altman S. Nat. Rev. Drug Discov. 2012;11:125.
7. Gryaznov S.M.; Letsinger R.L. Nucleic Acids Res. 1992;20:3403.
8. Eckstein F. Acc. Chem. Res. 1979;12:204.
9. Guga P.; Stec W.J. Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 2003;4.17.
10. Koziolkiewicz M. et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997;7:43.
11. Griffiths A.D. et al. Nucleic Acids Res. 1987;15:4145.
12. Potter B.V.L. et al. Biochemistry. 1983;22:1369.
13. Stec W.J. et al. Nucleic Acids Res. 1991;19:5883.
14. Yu D. et al. Bioorg. Med. Chem. 2000;8:275.
15. Veedu R.N.; Wengel J. Chem. Biodivers. 2010;7:536.
16. Furrer P. et al. J. Mol. Biol. 1999;285:1609.
17. Haupt W.; Pingoud A. J. Chromatogr. 1983;260:419.
18. Thermo Fisher Scientific. Anion exchange LC–MS HRAM oligonucleotides. 2010.
19. Thayer J.R. et al. Anal. Bioanal. Chem. 2007;361:132.
20. Thayer J.R. et al. Anal. Biochem. 2005;338:39.
21. Seiffert S. et al. Anal. Biochem. 2011;414:47.
22. Schlech T. et al. Nucleic Acids Res. 1976;3:355.
23. Giannaris P.A.; Damha M.J. Nucleic Acids Res. 1993;21:4742.
24. Grant G.P.G. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008;451:451.