High Resolution LC/MS Analysis of Therapeutic Oligonucleotides on a New Porous Polymer-Based Reversed Phase Column

Význam tématu

Syntetické oligonukleotidy (ONs) jsou perspektivní terapeutické látky díky vysoké specifitě vazby na cílové sekvence a vyspělým technologickým postupům jejich přípravy a modifikace. Pro schválení a klinické nasazení je však nezbytné detailní potvrzení jejich identity, čistoty a strukturních modifikací, zejména základnových, cukrových a páteřních vazeb, které ovlivňují stabilitu v organismu a biologickou účinnost.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem popsané studie bylo ověřit novou kombinaci porézní polymerové reverzní fázové kolony a iontově-párové mobilní fáze pro rychlou LC/MS analýzu terapeutických oligonukleotidů. Demonstrace zahrnovala separaci a identifikaci cílových ON produktů, n-1 neúplných sekvencí, fosforotioátových diastereomerů, 2′-O-methylovaných siRNA a CpG methylovaných sekvencí za gradientů trvajících 3–5 minut.

Použitá metodika a instrumentace

Ultrarapidní separace a detekce byly provedeny na sestavě Thermo Scientific™ Dionex™ UltiMate™ 3000 BioRS:

• Kolona: Thermo Scientific™ DNAPac™ RP, 4 μm, 2.1×50 mm
• Pumpy a systém: SR-3000 solvent rack, LPG-3400RS Quaternary Rapid Separation Pump, WPS-3000TBRS autosampler, TCC-3000RS column compartment
• Detekce UV: VWD-3400RS, 260 nm, mikroflow buňka
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific™ Q Exactive™ Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap, negativní iontový režim
• Mobilní fáze: iontově-párové složení TEA/HFIP v různém poměru vody/methanolu (pH 7.6, 7.9 nebo 9.9)

Hlavní výsledky a diskuse

• Rychlá separace cílových 21mer DNA a n-1 neúplných sekvencí během 3 minut: vysoce citlivé UV a orbitrap MS rozlišení potvrdily identitu a ztrátu jednotlivých bazí v neúplných fragmentech.
• Rozlišení diastereomerů fosforotioátově modifikovaných siRNA: čtyři možné stereoizomery při záporném 4× nabití byly baseline separovány díky vysoké pH mobilní fáze.
• Analýza 2′-O-methylovaných siRNA: separace všech čtyř diastereomerů obsahujících modifikace na 6. a 14. bázi.
• Detekce a separace CpG methylovaných 15mer DNA: posun hmotnostního signálu odpovídal jedné přidané methylové skupině, baseline rozlišení methylovaného a nemethylovaného ON.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení analýz na několik minut umožňuje vysokopropustné sledování kvality syntézních ON v průmyslových i akademických laboratořích.
• Možnost souběžného hodnocení čistoty, neúplných sekvencí a různých modifikací poskytuje komplexní profil lékových kandidátů.
• Metoda podporuje QA/QC procesy, vývoj a validaci terapeutických oligonukleotidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace LC/MS workflow a integrace s robotickými přípravami vzorků pro zvýšení propustnosti.
• Rozšíření metod na nové typy modifikací, hybridní nukleové kyseliny a konjugáty (např. PEGylace, peptidní připojení).
• Pokročilá datová analýza a strojové učení pro hlubší charakterizaci složitých směsí biologicky aktivních ON.

Závěr

Vývoj nové porézní polymerové RP kolony v kombinaci s vysokopH iontově-párovými mobilními fázemi a orbitrap MS umožnil rychlou a vysoce rozlišnou analýzu terapeutických oligonukleotidů včetně jejich modifikací a neúplných sekvencí. Tento přístup poskytuje robustní nástroj pro výzkum a kontrolu kvality moderních léčebných ON.

Reference

1. Dias N., Stein C. A. Molecular Cancer Therapeutics. 2002;1:347–355.
2. Resnier P., et al. Biomaterials. 2013;34(25):6429–6443.
3. Jones P. A., Baylin S. B. Nature Reviews Genetics. 2002;3:415–428.