A glycopeptide standard for improving glycoprotein hydrolysis reaction yield for accurate monosaccharide content determination

Význam tématu

High-performance anion-exchange chromatography s pulzně amperometrickou detekcí (HPAE-PAD) je klíčová pro stanovení monosacharidového složení glykoproteinů v biotechnologických a farmaceutických aplikacích. Přesná kvantifikace uvolněných monosacharidů je nezbytná pro zajištění kvality glykované bílkovinné terapie a porovnatelnost meziproduktů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit využití komerčně dostupného glykpeptidového standardu jako pozitivní kontroly pro efektivitu acidní hydrolýzy glykoproteinů. Testované vzorky zahrnovaly glykpeptid, fetuin a alfa1-kyselou glykoprotein (AGP) podrobené hydrolýze za dvou různých podmínek: silná kyselina chlorovodíková (HCl) pro aminosacharidy a trifluoroctová kyselina (TFA) pro neutrální cukry. Následné analýzy pomocí HPAE-PAD na kolonce Thermo Scientific Dionex CarboPac PA20-Fast umožnily porovnání výtěžnosti monosacharidů.

Použitá metodika a instrumentace

• Hydrolýza: 4 hodin při 100 °C v TFA nebo 6 M HCl, následné sušení ve SpeedVac koncentrátoru.
• Rekonsitutce vzorků v deionizované vodě, 5 µL injekce do chromatografu.
• Chromatograf: Thermo Scientific Dionex ICS-5000+ RFIC systém s CarboPac PA20-Fast 2 × 100 mm kolonkou a 2 × 30 mm guard kolonkou, teplota 30 °C.
• Eluent: generátor KOH EGC 500, gradient 10–100 mM KOH.
• Detekce: elektrochemický detektor s Au pracovní elektrodou, systém Ag/AgCl referenční elektrodou.
• Reagencie a standardy: glykpeptid BioQuant GPEP A2G2S2, monosacharidové standardy Thermo Scientific MonoStandard, proteiny fetuin a AGP.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatogramy glykpeptidu ukázaly všechny očekávané monosacharidové špičky.
• HCl hydrolýza vykázala téměř teoretický výtěžek glukosaminu a galaktosaminu u glykpeptidu i glykoproteinů, potvrzující úplné uvolnění aminosacharidů.
• TFA hydrolýza přinesla nižší výtěžnost neutrálních cukrů (mannóza, galaktóza, fukóza) u všech vzorků.
• Podobné trendy výtěžností u glykpeptidu a skutečných glykoproteinů podporují použití standardu pro optimalizaci hydrolýzy.

Přínosy a praktické využití metody

• Zajištění reprodukovatelné a kvantitativní hydrolýzy glykoproteinů pro QC glykoproteinových léčiv.
• Možnost aplikovat glykpeptid jako interní pozitivní kontrolu ke zvýšení přesnosti a spolehlivosti stanovení monosacharidového profilu.
• Přenositelnost metody do rutinních laboratoří díky použití komerčně dostupných standardů a elastického nástroje HPAE-PAD.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace kyselých podmínek hydrolýzy, včetně kombinací různých acidit a teplotních režimů.
• Vývoj nových glykpeptidových nebo oligosacharidových standardů pro širší pokrytí glykana.
• Integrace s moderními iontovými výměnnými a kapalinovými chromatografiemi nebo hmotnostní spektrometrií pro komplexní glykanové analýzy.
• Automatizace vzorkové přípravy a hydrolýzy v high-throughput formátu.

Závěr

Použití standardního glykpeptidu pro kontrolu hydrolýzy umožňuje přesnější stanovení monosacharidové kompozice glykoproteinů. Díky vysoké reprodukovatelnosti HCl hydrolýzy pro aminosacharidy a charakterizovanému výtěžku neutrálních cukrů lze standard doporučit jako pozitivní kontrolu v rutinních QC protokolech.

Reference

• 1. Thermo Scientific Technical Note TN40, Glycoprotein monosaccharide analysis using HPAE-PAD with eluent generation.
• 2. Rohrer JS, Basumallick L, Hurum D. High-Performance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection for Carbohydrate Analysis of Glycoproteins. Biochemistry (Moscow), 2013, 78:697–709.
• 3. Rohrer JS. Monosaccharide Analysis of Glycoproteins by HPAE-PAD. In: Applications of Ion Chromatography in the Analysis of Pharmaceutical and Biological Products, John Wiley and Sons, 2012; Chapter 18:339–350.
• 4. Thermo Scientific Technical Note TN72225, Glycoprotein monosaccharide analysis using HPAE-PAD with manually prepared eluent.
• 5. Thermo Scientific Technical Note TN71, Eluent Preparation for High-Performance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection.
• 6. Thermo Scientific Technical Note TN72580, An improved HPAE-PAD method for glycoprotein monosaccharide determination.
• 7. Fan JQ, Namiki Y, Matsuoka K, Lee YC. Comparison of acidic conditions for Asn-linked oligosaccharides. Anal Biochem, 1994, 219:385–378.