Glycoprotein monosaccharide analysis using HPAE-PAD with manually prepared eluent

Význam tématu

Glykozylace je zásadní posttranslační modifikací, která ovlivňuje stabilitu, konformaci a biologickou funkci proteinů. V biotechnologii a farmaceutickém průmyslu je kvantifikace monosacharidů v glykoproteinech nezbytná pro kontrolu kvality léčiv, vývoj biosimilars a pochopení biologických mechanismů spojených se změnami glykanů.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyvinout a ověřit validní metodu pro stanovení šesti základních monosacharidů (fukóza, galaktosamin, glukosamin, galaktóza, glukóza, mannóza) v glykoproteinech pomocí vysokotlaké aniontové chromatografie s pulzní amperometrií (HPAE-PAD) a manuálně připraveného elučního roztoku. Jako modelové proteiny byly použity lidské IgG, fetuin a alfa-1-kyselý glykoprotein (AGP), hydrolyzované buď kyselinou chlorovodíkovou (HCl) pro aminocukry, nebo trifluoroctovou (TFA) pro neutrální cukry. Studie hodnotila linearitu, přesnost, detekční limity, robustnost a správnost metody.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Dionex ICS-5000+ RFIC systém s DP dvojitou pumpou, DC detekční komorou a elektrochemickým detektorem
• Pracovní elektroda zlatá na PTFE a referenční pH Ag/AgCl elektroda
• Kolona Dionex CarboPac PA20 (3×150 mm) se strážnou kolonkou Dionex AminoTrap (3×30 mm) a BorateTrap
• Autosampler AS-AP s chlazenou vaničkou

Použitá metodika

Vzorky glykoproteinů byly hydrolyzovány dvěma postupy: HCl pro uvolnění aminocukrů a TFA pro neutrální monosacharidy. Po čtyřhodinové inkubaci při 100 °C a sušení ve SpeedVac byly vzorky rekonstituovány v DI vodě. Eluenty byly manuálně připraveny jako 10 mM NaOH (isokraticky) a 200 mM NaOH (regenerační krok). Chromatografické podmínky: teplota kolony 30 °C, průtok 0,5 mL/min, injekční objem 10 µL, délka metody 32 min s oddělením analytické fáze a vyplachovacího kroku. Inline BorateTrap odstraňuje borátovou kontaminaci, AminoTrap zadržuje aminokyseliny a peptidy.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje baseline separace šesti monosacharidů v analytické fázi do 13 min, celkový běh trvá 32 min. Chromatogramy IgG, fetuinu a AGP pro HCl a TFA hydrolysáty ukazují očekávané převahy aminocukrů v HCl a neutrálních cukrů v TFA hydrolysátech. Linearita kalibrací dosáhla koeficientů determinace 0,983–0,999. Opakovatelnost a mezi­denní přesnost vykázaly RSD < 3,4 % pro retenční časy i velikosti píků. Detekční meze se pohybují v rozmezí 0,1–0,25 µM (S/N ≥ 10). Správnost stanovení byla potvrzena recovery 80–120 % při provedení spike-in testů. Robustnost metody při ±10 % změnách klíčových parametrů dokládá stabilitu separace, jedinou významnější odchylku (do 18 % snížení rozlišení) způsobila nižší teplota na starší kolonně.

Přínosy a praktické využití metody

• Bez nutnosti derivatizace, přímá detekce snižuje dobu analýzy, náklady a práci s nebezpečnými činidly
• Vysoká selektivita a citlivost umožňuje měření i v nízkokoncentrovaných vzorcích
• Metoda je vhodná pro rutinní kontrolu kvality glykoproteinových léčiv a vývoj biosimilars

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné rozšíření zahrnuje integraci s eluenční generací in situ, spojení s hmotnostní spektrometrií pro strukturální analýzu glykanů, automatizaci přípravy vzorku a zvýšení propustnosti v mikroplatových formátech. Dalším směrem je rozvoj detekce kyselých sacharidů (sialové kyseliny) a komplexních oligosacharidů v jednom běhu.

Závěr

Popsaná HPAE-PAD metoda s manuálně připraveným NaOH eluentem poskytuje spolehlivou, citlivou a robustní analýzu šesti monosacharidů v glykoproteinech. Validace podle USP <1225> potvrzuje její vhodnost pro rutinní farmaceutické aplikace i výzkumné účely.

Reference

• Spiro RG. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 2002;12(4):43R-56R.
• Shental-Bechor D, Levy Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105(24):8256-61.
• Brandley BK, Schnaar RL. Cell-surface carbohydrates in cell recognition and response. J Leukoc Biol. 1986;40(1):97-111.
• Dranitsaris G, Amir E, Dorward K. Biosimilars of biological drug therapies: regulatory, clinical and commercial considerations. Drugs. 2011;71(12):1527-36.
• Thermo Scientific Technical Note 40. Glycoprotein monosaccharide analysis using HPAE-PAD with eluent generation. TN40; 2012.
• Thermo Scientific Technical Note 71. Eluent preparation for HPAE-PAD. TN71; 2017.
• Thermo Scientific Technical Note 125. Guidelines for successful use of Dionex AminoTrap columns. TN125; 2017.
• Thermo Scientific CarboPac PA20 column manual. Doc. 031884-05; 2017.
• United States Pharmacopeia General Chapter <1225> Validation of Compendial Procedures. USP 39–NF 34; 2017.