Determination of Glycoprotein Monosaccharide Composition by HPAE-PAD Using On-Line Electrolytically Generated Eluents

Význam tématu

Analýza monosacharidové kompozice glykoproteinů je klíčová v biotechnologickém výzkumu, farmaceutické výrobě a kvalitativní kontrole. Technika HPAE-PAD s elektrolyticky generovaným hydroxidovým elu­entem zajišťuje vysokou citlivost a reprodukovatelné retenční časy bez nutnosti manuální přípravy zásaditých roztoků.

Cíle a přehled studie

Cílem Technical Note bylo představit optimalizované podmínky pro stanovení šesti běžných monosacharidů (L-fukóza, D-galaktosamin, D-glukosamin, D-galaktóza, D-glukóza, D-manóza) z hydrolyticky uvolněných glykoproteinů pomocí HPAE-PAD s on-line generovanou KOH eluentní fází. Studie popisuje nastavení přístrojů, přípravu vzorků a vyhodnocení výkonu metody.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografický systém Dionex DX-600 s GP50 pumpou a EG40 Eluent Generator modulem, EGC-KOH kazetou a EG40 Vacuum Degas kit pro nulové kontaminanty CO₂.
• Detekce ED40/50 pulzní amperometrií se zlatou pracovní elektrodou a čtyřstupňovým potenciálovým waveformem.
• Kolony: CarboPac PA10 (4×250 mm) s předkolonami ATC-1, BorateTrap a AminoTrap zajišťující odstranění karbonátů, borátů i aminů z eluentu.
• Eluce: isokratická 18 mM KOH, 1,0 mL/min, 20 min; regenerace 100 mM KOH 5 min + ekvilibrace 15 min (celkem 40 min cyklus).
• Hydrolyza vzorků: 2 N TFA pro neutralní sacharidy (100 °C, 4 h) a 6 N HCl pro aminové sacharidy (100 °C, 4 h), následná evaporace a rehydratace v reagentní vodě.

Hlavní výsledky a diskuse

• Detekční limity ~0,75 pmol a lineární rozsah 0,5–500 pmol pro všechny analyty.
• Retenční časy stabilní (RSD ≤ 0,3 %) i po více než 200 injekcích.
• Rozlišení šesti monosacharidů na CarboPac PA10 v průběhu 20 minut bez průnikového šumu.
• Reprodukce hydrolyzačních postupů s RSD 1–2 % intra-vial a 3–10 % mezi hydrolyzáty.
• Monosacharidové složení modelových glykoproteinů (fetuin, transferrin, thyroglobulin, ribonukleáza B, mucin) odpovídá literárním datům.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace manuální přípravy a skladování hydroxidových elučních roztoků.
• Zvýšená reprodukovatelnost a přesnost retencí díky eliminaci kontaminace uhlíkem.
• Minimalizace údržby kolony díky efektivnímu čištění a regeneraci KOH garantované pulzním programem.
• Vhodné pro rutinní kontrolu kvality i výzkumné studie glykoproteinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizovaná příprava vzorků a miniaturizované kapilární formáty pro vzorky s omezeným množstvím.
• Integrace HPAE-PAD s LC-MS pro detailní strukturální analýzu sacharidů a izomerů.
• Nové iontově výměnné a povrchově modifikované materiály pro vyšší rozlišení monosacharidů.
• Vývoj rychlejších gradientních metod a paralelních systémů pro zvýšení throughput.

Závěr

Metoda HPAE-PAD s on-line elektrolyticky generovanou KOH eluentní fází poskytuje robustní, citlivé a reprodukovatelné stanovení monosacharidů z glykoproteinů bez komplikací spojených s manuální přípravou zásad. Soubor optimalizovaných podmínek umožňuje rutinní analýzu i v náročných aplikacích QC a výzkumu.

Reference

• Fan J.-Q.; Namiki Y.; Matsuoka K.; Lee Y.C. Optimization of Glycoprotein Hydrolysis Conditions for Monosaccharide Analysis. Anal. Biochem. 1994, 219, 375–378.
• Dionex TN21: Analysis of Carbohydrates by High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection (HPAE-PAD); Dionex Corp., 1993.
• Townsend R.R.; Manzi A.; Merkle R.K.; Rohde M.F.; Spellman M.; Smith A.; Carr S.A. Multicenter Study of Quantitative Carbohydrate Analysis; www.abrf.org/ABRFNews, 1997.