Analysis of Inositol Phosphates

Význam tématu

Inositol fosfáty představují klíčové druhé posluchače v regulaci buněčných procesů, zejména mobilizaci Ca2+. Přesné stanovení jednotlivých izomerů je zásadní pro pochopení jejich role ve fyziologii a patologii.

Cíle a přehled studie / článku

Studie prezentuje využití vysokovýkonné aniontově-výměnné chromatografie kompatibilní se solventy a chemicky potlačenou vodivostní detekcí pro separaci a kvantifikaci inositol fosfátů (mono-, di-, tri- a tetra-fosfáty) bez nutnosti derivatizace.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda využívá systém Dionex DX500 BioLC vybavený:

• GP40 Gradient Pump
• CD20 Conductivity Detector nebo ED40 Electrochemical Detector
• LC20 Chromatography Enclosure
• AS3500 Autosampler
• PAX-100 kolonu (4×250 mm) s ochranou (4×50 mm)

Chromatografická separace probíhá za použití elučního trojsložkového gradientu (voda, 200 mM NaOH, 50 % isopropanol) a samo-regeneračního potlačovače ASRS v externím režimu.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda zajistila baseline separaci inositol monofosfátů, difosfátů, trifosfátů a tetrafosfátů v časech 15–25 minut. Citlivost detekce dosahuje 70 pmol pro Ins(1)P, lineární rozsah až do 200 nmol. Kombinovaná analýza mono-, di- a trifosfátů byla demonstrována v jediné injekci s krokovým gradientem.

Přínosy a praktické využití metody

Výhody zahrnují absenci pre- či postkolonní derivatizace, vysokou selektivitu pro izomery, rychlou analýzu a možnost simultánního sledování více fosfátových forem.

Budoucí trendy a možnosti využití

Perspektivně lze metodu integrovat s hmotnostní spektrometrií, miniaturizovat systém pro rychlejší screening a rozšířit aplikace v klinickém výzkumu signálních drah či v průmyslové QC.

Závěr

Solventově kompatibilní HPAEC s chemicky potlačenou detekcí představuje robustní a citlivý přístup k analýze inositol fosfátů, poskytující jasnou separaci izomerů a široký lineární rozsah detekce.

Reference

• Berridge MJ a Irvine RF. Nature. 1989;341:197–205.
• Irvine RF, Anggard EE, Letcher AJ, Downes CP. Biochem J. 1985;229:505–511.
• Leavitt AL, Sherman WR. Methods Enzymol. 1982;89:9–18.
• Seiffert UB, Agranoff BW. Biochem Acta. 1965;98:574–581.
• Shayman JA, Bement DM. Biochem Biophys Res Commun. 1988;151:114–122.
• Smith RE et al. J Chromatogr. 1988;439:83–92.
• Pittet D et al. J Biol Chem. 1989;264:18489–18493.
• Dean NM, Moyer JD. Biochem J. 1987;242:361–366.
• Smith RE, MacQuarrie RA, Jope RS. J Chromatogr Sci. 1989;27:491–495.