Determination of Protein Molecular Weight and Size Using the Agilent 1260 Infinity Multi-Detector Bio-SEC Solution with Advanced Light Scattering Detection

Význam tématu

Určení molekulové hmotnosti a velikosti proteinů je klíčové pro charakterizaci bioterapeutik a výzkum biologických molekul. Metoda SEC spojena s pokročilou detekcí světla umožňuje přesné a nezávislé měření bez nutnosti kalibrace kolony a citlivé odhalení agregátů.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje použití chromatografického systému Agilent 1260 Infinity Multi-Detector Bio-SEC Solution k určení molekulové hmotnosti (MW) a hydrodynamického poloměru (RH) proteinů o rozsahu 11–670 kDa. Cílem bylo prokázat nezávislost výsledků na objemu vzorku a zvýšenou citlivost detekce agregátů pomocí statické (90°) a dynamické (DLS) detekce světla doplněné UV měřením.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace:

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary Pump (G5611A)
• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Autosampler (G5667A) s chlazením na 5 °C
• Agilent 1290 Infinity Thermostat (G1330B) a Column Compartment (G1316C) s bio-inertním výměníkem
• Agilent 1260 Infinity DAD VL (G1315D) s bio-inertní kyvetou, detekce při 280 nm
• Agilent 1260 Infinity Multi-Detector Suite (G7805A) s duální statickou LS (90°) a DLS (G7809A)
• Kolona Agilent Bio SEC-3, 300 Å, 7.8×300 mm, 3 µm

Provozní podmínky:

• Mobilní fáze: PBS pH 7.4, průtok 0.75 mL/min, doba běhu 20 min
• Teplota kolony 30 °C, autosampler 5 °C
• DLS: korelační běh 5 s, klip time 10 µs, eluentní viskozita 0.0079 p, refraktometrický index 1.333

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza pěti standardních proteinů (cytochrom c, lysozym, ovalbumin, IgG, thyroglobulin) prokázala:

• Molekulová hmotnost odpovídá literatuře s RSD 0.7–2.9 %, výjimkou je thyroglobulin (oddělení monomeru omezeno špatným rozlišením agregátů)
• Hydrodynamický poloměr (RH) měřený DLS se shoduje s literárními hodnotami v rozsahu 2.2–8.4 nm, RSD 5–13 %
• Statická LS (90°) vykazuje vyšší citlivost při detekci agregátů než UV při 280 nm
• DAD prokázal výbornou linearitu v rozsahu 39 µg/mL až 10 mg/mL (R²>0.999)

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlé a přesné určení MW a velikosti proteinů bez kalibrace, odhalení nízko- a vysokomolekulárních agregátů a kvantifikaci s vysokou linearitou. Vhodná je pro vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik, studium stability proteinových formulací a screening vzorků ve farmaceutické výrobě.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace dalších detekčních technik (např. fluorescence, MALS s vyšším počtem úhlů)
• Automatizace přípravy vzorků a datové analýzy s využitím strojového učení
• Rozšíření aplikace na komplexní biologické směsi a nanoparticle characterization
• Miniaturizace a přenositelnost systémů pro in-line procesní monitorování

Závěr

Agilent 1260 Infinity Multi-Detector Bio-SEC Solution kombinuje statickou a dynamickou detekci světla s UV detekcí, což vede k robustnímu, citlivému a reprodukovatelnému určení molekulové hmotnosti a velikosti proteinů v širokém rozsahu molekulových hmotností. Systém je vhodný pro náročné aplikace v oblasti bioterapeutik a biologické analýzy.

Reference

• Schneider S. Determination of Protein Molecular Weight and Size Using the Agilent 1260 Infinity Multi-Detector Bio-SEC Solution with Advanced Light Scattering Detection. Agilent Technologies, 2014.