Detailed Aggregation Characterization of Monoclonal Antibodies Using the Agilent 1260 Infinity Multi-Detector Bio-SEC Solution with Advanced Light Scattering Detection

Význam tématu

Sledování agregace monoklonálních protilátek je klíčové pro zajištění jejich stability, účinnosti a bezpečnosti v biotechnologické výrobě a farmaceutických přípravcích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnání tradiční SEC analýzy s detekcí UV a přímé určení molekulové hmotnosti (MW) pomocí statického měření rozptylu světla (LS) na přístroji Agilent 1260 Infinity Multi-Detector Bio-SEC Solution. Analýza byla provedena na dvou monoklonálních protilátkách a jejich agregátech.

Použitá metodika a instrumentace

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary Pump a High Performance Bio-inert Autosampler
• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Diode Array Detector (DAD) se 280 nm detekcí
• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Multi-Detector Suite s dvojúhlou statickou a dynamickou LS detekcí
• Kolonka Agilent Bio SEC-3 300 Å, 7.8×300 mm, 3 µm
• Inline filtr s 0.2 µm membránou před LS detektorem
• Mobilní fáze: PBS pH 7.4, tok 0.75 mL/min, teplota kolony 30 °C, autosampler 5 °C

Hlavní výsledky a diskuse

• MW stanovená LS detektorem byla nezávislá na množství vzorku (1–120 µg) s maximální odchylkou 3,3 % okolo 150 kDa.
• Statická LS detekce prokázala výrazně vyšší citlivost při detekci agregátů než UV při 280 nm.
• DAD vykázal v rozsahu 78 µg/mL až 10 mg/mL vynikající linearitu s R² = 0.9999.
• Protilátka vykazující nespecifické interakce s kolonkou byla tradiční kalibrací detekována chybně, což LS detektor korigoval.

Přínosy a praktické využití metody

Kombinace SEC s dvojúhlou LS a citlivou DAD detekcí zajišťuje spolehlivou kvantifikaci a charakterizaci agregací mAbs během vývoje, výroby a kontroly kvality bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření online dynamické LS, vylepšení softwaru pro automatizované hodnocení agregací a integrace metod field flow fractionation pro separaci komplexních biopolymerů.

Závěr

Použití Agilent 1260 Infinity Bio-SEC řešení s LS detekcí přináší robustní a vysoce citlivou metodiku pro přesné stanovení molekulové hmotnosti a agregací monoklonálních protilátek, překonávající omezení tradiční SEC kalibrace.

Reference

• Gabrielson JP et al. Quantitation of Aggregate Levels in a Recombinant Humanized Monoclonal Antibody Formulation by Size-Exclusion Chromatography, Asymmetrical Flow Field Flow Fractionation, and Sedimentation Velocity. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2007;96(2):268-279.
• Nobbmann U et al. Dynamic light scattering as a relative tool for assessing the molecular integrity and stability of monoclonal antibodies. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 2007;24(1):117-128.
• Armstrong JK et al. The Hydrodynamic Radii of Macromolecules and Their Effect on Red Blood Cell Aggregation. Biophysical Journal. 2004;87:4259-4270.