Targeted small protein analysis with a single quadrupole mass detector

Význam tématu

Analýza malých proteinů hraje zásadní roli v kontrolách kvality a validaci výrobních procesů v biotechnologii a farmaceutickém průmyslu. K potvrzení identity a čistoty proteinů se čím dál častěji využívá hmotnostní spektrometrie. Ačkoli špičkové HRAM přístroje poskytují vysoké rozlišení, pro mnohé rutinní úlohy postačuje unit mass resolution, kterou nabízí single quadrupole mass detektor za nižší pořizovací a provozní náklady.

Cíle a přehled studie / článku

Tato technická poznámka popisuje aplikaci Thermo Scientific ISQ EM single quadrupole mass detektoru integrovaného do Chromeleon CDS s balíčkem Intact Protein Deconvolution (IPD). Cílem bylo demonstrovat možnost přesné analýzy malé směsi šesti proteinů o hmotnosti od ~9 do 70 kDa, ukázat spolehlivost detekce, dekonvoluce spekter a vyčíslit odchylky naměřených hmotností.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: Vanquish Flex Binary UHPLC systém s modulem Horizon/Flex, Binary Pump F (35 µL mixer), Split Sampler FT, Column Compartment H, Variable Wavelength Detector F (2,5 µL flow cell).
• Kolona: Thermo Scientific MAbPac-RP, 4 µm, 2,1 × 50 mm.
• Mobile phase: A – voda + 0,1 % kyseliny mravenčí, B – acetonitril + 0,1 % kyseliny mravenčí; gradient 10–55 % B (0–25 min), následně do 95 % B (26 min) a návrat na 10 % B (27–31 min).
• Flow rate 0,6 mL/min, teplota kolony 75 °C, injekční objem 1 µL, UV detekce 214 nm (100 Hz).
• MS detekce: ISQ EM v režimu Full Scan (500–2000 m/z), HESI ionizace, pozitivní iony, zdrojové podmínky ve výchozím „Easy mode“ s nastavenou nejvyšší citlivostí.
• Software: Chromeleon CDS 7.3 s integrovaným BioPharma Finder IPD (ReSpect algoritmus) pro dekonvoluci spekter v rozmezí 8 000–70 000 Da.

Hlavní výsledky a diskuse

• Všechny tři menší proteiny (<15 kDa) i tři větší proteiny (21–70 kDa) byly ve směsi jasně separovány a detekovány UV i MS detektorem.
• Mass deviation pro proteiny do ~15 kDa byla <2 Da, pro proteiny do 28 kDa do ~8 Da, pro 50 kDa ~11 Da a pro 68 kDa ~21 Da.
• Zvýšení odchylky odpovídá součinu jednotkové přesnosti MS (0,1 m/z) a použitého rozsahu nábojových stavů při dekonvoluci.

Přínosy a praktické využití metody

• Cenově úsporné řešení pro potvrzení hmotnosti v rutinním QC bez nutnosti HRAM přístrojů.
• Plná integrace detekce a dekonvoluce v Chromeleon CDS zajišťuje jednoduchou obsluhu a GxP kompatibilitu.
• Možnost nasazení v laboratořích s menší zkušeností s MS díky automatizovaným zdrojovým nastavením a přednastaveným parametrům dekonvoluce.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zvyšování throughputu analýz nasazením krátkých gradientů a automatizace provozu.
• Rozšíření aplikace na středně velké proteiny a komplexní biologické směsi.
• Možná integrace s řízenými výrobními linkami pro on-line monitoring čistoty a identity proteinů.

Závěr

Analýza malých proteinů pomocí Thermo Scientific ISQ EM single quadrupole detektoru integrovného do Chromeleon CDS s IPD poskytuje spolehlivou hmotnostní konfirmační metodu s odchylkou <2 Da pro proteiny do 15 kDa a do ~21 Da pro proteiny do 70 kDa. Tato kombinace je cenově efektivní a vhodná pro rutinní kontrolu kvality v regulovaných prostředích.

Reference

• Thermo Scientific BioPharma Finder, User Guide—Software version 4.0. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/manuals/man-xcali-98190-biopharma-finder-user-manxcali98190-en.pdf