High-throughput analysis of oligonucleotides using a single quadrupole mass spectrometer for quality control

Význam tématu

Rychlá a spolehlivá kontrola kvality syntetizovaných oligonukleotidů je klíčová pro vývoj v oblastech imunologie, virologie a RNA-terapeutik. S rostoucí poptávkou po personalizovaných DNA/RNA sekvencích, zejména v souvislosti s pandemií COVID-19 a rozvojem antisense terapií, je nezbytné zajistit validitu a čistotu těchto molekul.

Cíle a přehled studie

Studie byla zaměřena na předvedení kompletního postupu od příjmu syntetizovaného vzorku až po elektronicky generovanou zprávu o hmotnosti cílového oligonukleotidu. Konkrétně bylo cílem ukázat využití jednoho kvadrupólového hmotnostního spektrometru ve spojení s UHPLC a softwarovou platformou Chromeleon CDS pro kvalifikaci a kvantifikaci oligonukleotidů o délce 10–60 nukleotidů.

Použitá instrumentace

• UHPLC Thermo Scientific Vanquish Flex s DNAPac RP kolonnou (2,1 × 50 mm, 4 µm)
• Single kvadrupólový hmotnostní spektrometr ISQ EM s HESI ionizačním zdrojem
• Detektor UV (λ=260 nm)
• Software Chromeleon CDS včetně modulu Intact Protein Deconvolution a oligonukleotidové analýzy

Použitá metodika

Vzorky byly odebírány přímo z 96-destičky po syntéze a injektovány bez další přípravy. Pro chromatografii byly využity mobilní fáze A a B obsahující variabilní koncentrace 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-isopropanolu (HFIP) s triethylaminem (TEA). Gradientní program zajišťoval oddělení soli a zbytkových činidel od hlavního produktu během 1,6 minuty. Optimalizace zdrojových parametrů MS zahrnovala:

• Optimalizaci koncentrace HFIP (testovány 0,01–2 %), nejvyšší citlivost a nejnižší addukce HFIP prokázána při 0,1 %
• Optimalizaci teploty vaporizeru a přenosové trubice (300–450 °C resp. 300–400 °C)
• Využití Custom Injection Variables v Chromeleon pro rychlou iterativní změnu parametrů bez vytváření nových metod

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace mobilní fáze vedla k 20× snížení spotřeby HFIP při zachování nebo zlepšení kvality hmotnostních spekter. Chromatografická metoda zajistila symetrické špičky pro délky oligonukleotidů 10–60 merů. Zdrojové parametry MS umožnily maximalizovat intenzitu hlavního náboje a minimalizovat HFIP addukci. Deconvoluce spekter s nastavením Intact Protein Deconvolution poskytla spolehlivé výpočty intact hmotnosti. Implementace Custom Injection Variables, očekávané hmotnosti a cílové tolerance v sekvenci umožnila automatické generování pass/fail zprávy o shodě naměřené a teoretické hmotnosti.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Minimální přípravu vzorku – injekce vzorku přímo z DNA synthesizeru
• Úsporu provozních nákladů až o 20× nižší spotřebou HFIP
• Rychlý LC běh (<2 min) vhodný pro vysokoprůchodové aplikace
• Automatizované vyhodnocení výsledků s přehledným reportem

Budoucí trendy a možnosti využití

• Adaptace na syntézy delších oligonukleotidů a modifikovaných nukleotidů
• Integrace do plně automatizovaných QA/QC linek v biotechnologických provozech
• Rozšíření datové analýzy o statistické sledování kvality a prediktivní údržbu instrumentace
• Možnost rozšíření workflow o tandemovou MS nebo high-resolution hmotnostní spektrometrii

Závěr

Prezentovaný workflow spojuje rychlou UHPLC separaci, optimalizovanou single kvadrupólovou MS analýzu a automatizované vyhodnocení intact hmotnosti. Výsledkem je robustní a nákladově efektivní řešení pro vysokoprůchodovou kontrolu kvality syntetizovaných oligonukleotidů.

Reference

1. Michelson AM, Todd AR. J. Chem. Soc. 1955, 2632.
2. Sinha ND et al. Nucleic Acids Res. 1984, 12(11), 4539.
3. Bajan S et al. Cells. 2020, 9, 137.
4. Rossi JJ et al. Nucleic Acid Therapeutics. 2020, 30, 129.
5. Scharner J, Aznarez I. Mol. Ther. 2020, 29(2), 540.
6. Thermo Scientific Technical Note 73670: Quality control of oligonucleotides with a single quadrupole mass spectrometer.